山羊精子介导转染外源DNA重要候选分子的筛选鉴定及作用途径研究

精子介导转基因方法（sperm-mediated gene transfer, SMGT）是生产转基因动物的有效途径，具有简便、高效特点，但机制至今不明确，成了限制此方法运用的瓶颈和世界性难题，也造成SMGT存在极大的随机性和不确定性。目前国际上对此研究较少，且主要集中在CD4分子上。众多蛋白质之间在许多重要的生命活动中是彼此协调和控制的，蛋白质相互作用在生命活动中扮演关键角色。我们前期研究证明CD4分子在山羊精子内化外源DNA的过程中起主要作用，本项目以其为诱饵蛋白，⑴利用酵母双杂交系统，筛选并验证与CD4相互作用、参与精子转染外源DNA的新型侯选分子；⑵CD4与候选分子遗传分析和功能鉴定，利用性能测定资料，分析其与山羊精子转染外源DNA性状的关联；⑶CD4和重要候选分子聚合分析，构建其在山羊精子转染外源DNA中调控网络关系，进一步了解CD4功能，为精子介导基因转移机制研究开辟新的思路。

精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力，并在受精时导入卵母细胞，获得转基因动物。精子介导转基因方法（sperm-mediated gene transfer, SMGT）是生产转基因动物的有效途径，具有简便、高效特点，但机制至今不明确，方法存在极大的随机性和不确定性。众多蛋白质之间在许多重要的生命活动中是彼此协调和控制的，蛋白质相互作用在生命活动中扮演关键角色。CD4相互作用蛋白的筛选鉴定及功能研究将助于破解SMGT的机制，有理论研究和应用价值。在本项目的资助下，主要进行了：（1）建立了酵母双杂交系统，筛选了8个CD4相互作用分子（BSPRY、Pmpcb、RANBP9、Morc2b、Ggnbp2、CD320、Adam2 和Creld2），并对8条阳性基因进行生物信息学分析；（2）构建5个真核表达载体（pCDEF-Myc-MCD4、pCDEF-FLAG-CD44、pCDEF-FLAG-CD20、pCDEF-FLAG-CD1和pCDEF-FLAG-CD46），质粒两两共转293FT 细胞，用免疫共沉淀（Co-IP）方法验证了CD320(CD1)和RANBP9(CD20)与CD4存在相互作用；（3）克隆了山羊CD4、CD320和RANBP9基因，检测了在山羊各个组织的表达量，进行了群体遗传学分析；（4）检测了山羊CD4、CD320和RANBP9蛋白定位、分布及组织定位表达；（5）体内、体外研究了CD320、RANBP9在山羊精子转染外源DNA中的作用，初步表明CD320和RANBP9与CD4一起，是影响山羊精子结合内化外源DNA的关键分子。本项目筛选了2个与CD4相互作用分子，GenBank登录了3条新序列，为精子介导基因转移机制研究开辟了新的思路；发表论文31篇，SCI收录11篇（其中会议论文12篇，SCI收录3篇）；出版专著2部，申请专利4项，授权2项；指导研究生8名，已答辩毕业6名，培养年轻教师4名；参加国内外学术会议10次，其中国际会议4次。研究计划全部完成，并达到预期目标。