蛋清卵粘蛋白抗H1N1病毒特性及分子机制研究

开发应用天然抗病毒活性蛋白能够有效解决病毒性疾病防治疫苗的缺陷，因此天然活性蛋白的抗病毒作用机制的研究是近年来国内外蛋白质功能研究领域的热点问题。禽蛋卵粘蛋白（ovomucin）具有独特的抗病毒作用，在药品、食品等领域开发应用前景十分广阔。本项目以我国丰富的禽蛋资源为原料，围绕蛋清中ovomucin的抗H1N1病毒活性开展系统研究，拟从ovomucin功能与结构层面着手，应用病毒学和细胞学手段综合评价ovomucin体内外抗病毒的活性，通过现代仪器分析技术解析ovomucin化学结构与分子构象，尤其是糖链的结构特性，结合现代生化技术和蛋白组学手段探讨ovomucin抗病毒的关键活性位点，获得抗病毒药物设计的蛋白结构基础，从分子水平揭示其抗病毒反应的机制，不仅可以为抗病毒药物的设计和开发提供可靠依据，还可以提高禽蛋附加值，促进禽蛋资源的开发利用。

本研究以鸡蛋清中粘蛋白ovomucin)为研究对象，在纯化出高纯度蛋白质的基础上，以蛋白结构与功能为核心，对其体外抗病毒感染的活性与生化机制开展了系列研究工作：. 分步等电点盐析结合凝胶过滤色谱法从蛋清中分离纯化卵粘蛋白，质谱鉴定不含其它蛋白质。HPLC和SDS-PAGE显示纯度为99.13%，产率为(57.03 ±1.22)%，总回收率为(40.87±0.76)%。研究了提高卵粘蛋白溶解性的方法与机制。1 mol/L精氨酸中卵粘蛋白的溶解度是其在蒸馏水中的10倍以上。精氨酸浓度小30 mmol/L时主要通过静电作用与卵粘蛋白结合，未引起蛋白结构的显著变化。当精氨酸浓度大于100 mmol/L，ovomuicn无规则卷曲增加，折叠结构及螺旋结构减少，表面疏水性显著降低。. 通过细胞病变程度、细胞存活率、病毒抑制率以及血凝抑制等指标，评价卵粘蛋白对流感病毒H5N1、H1N1等五种病毒的抑制作用，结果发现卵粘蛋白对五株不同毒株均具有一定的抑制效果， 0.25 mg/mL的卵粘蛋白对H5N1、H1N1以及新城疫病毒II、V-4和IV系的血凝抑制率分别为(72.89±6.02)%、(64.29±7.94)%、(71.15±6.41)%、(60.32±9.16)%和(74.26±7.35)%。.采用红外光谱法和二维相关分析技术研究25-95 ℃升温过程中卵粘蛋白分子二级结构的变化依次为：α-螺旋，β-折叠，β-转角，无规卷曲。低浓度Mg2+与卵粘蛋白糖基结合，未造成蛋白二级结构的显著改变。高浓度Mg2+会使蛋白的无规则卷曲结构减少，β-转角和 β-折叠结构增加。随pH值升高，蛋白分子无规则卷曲结构逐渐转变为有序的折叠结构。 . 分析测定卵粘蛋白的总糖、总蛋白、糖醛酸、硫酸基、氨基糖及唾液酸的含量，证明卵粘蛋白分子中存在O-糖肽键。采用神经氨酸酶酶解卵粘蛋白，分离得到神经氨酸并进行了质谱鉴定，酶解率约为80.5%。探究了卵粘蛋白O-连接寡糖l链对其抗病毒活性的影响。ELISA检测了去除神经氨酸残基后的卵粘蛋白与流感病毒表面HA结合变化，结果发现糖链残基的去除对结合能力有显著影响。通过表面等离子共振（SPR）研究了去N-乙酰神经氨酸粘蛋白、天然卵粘蛋白与病毒表面关键抗原HA的结合，检测出相互作用的结合和解离常数，证明其基团在抗病毒活性中的作用。