细胞凋亡调控因子Bcl-xL、Bax、tBid的相互作用、构象变化和寡聚行为研究

Bcl-xL, Bax and tBid belong to Bcl-2 family. Bcl-xL inhibits the apoptosis while Bax, tBid promote the process. Both Bcl-xL and Bax may form pores in mitochondria and regulate the release of cytochrome c. Here we will study the interaction, conformational change and oligomerization of Bcl-xL, Bax and tBid by single molecule fluorescence technology. Specifically, we are going to study the interactions among Bcl-xL,Bax,tBid in solution and in membrane, the conformational change of Bcl-xL and Bax during their pore formation, the structural difference of Bcl-xL, Bax pores. Also, we will answer the questions such as: whether tBid activates Bax in a one step, "Hit-and-Run" manner；whether Bcl-xL interacts with the membrane-bound Bax and translocates Bax from membrane into solution. If Bcl-xL could translocate Bax into solution, would they keep as a complex or be separated as monomers in solution? Obviously, finding the answers of these questions will not only help elucidate the mechanism of how Bcl-2 family proteins regulate the apoptosis, but also aid the inhibitor design of Bcl-xL and Bax proteins.

Bcl-xL、Bax、tBid都属于Bcl-2家族，Bcl-xL抑制细胞凋亡，而Bax、tBid促进凋亡；Bcl-xL、Bax能在线粒体上形成膜通道，调控细胞色素c的释放。本课题采用单分子荧光技术，研究Bcl-xL、Bax、tBid的相互作用、构象变化和寡聚行为。具体来讲，我们将研究Bcl-xL、Bax、tBid在溶液和膜环境中的相互作用；tBid是否采取"Hit-and-Run"的方式激活Bax；Bcl-xL、Bax在形成膜通道过程中的构象变化；Bcl-xL、Bax膜通道在聚集状态上的差异；Bcl-xL是否结合膜上的Bax并将其转移到溶液中；如果Bcl-xL能将膜上的Bax转移到溶液中，那么之后，两者是继续保持结合，还是各自以单体的形式存在于溶液中。显然，找到这些问题的答案将有助于阐明Bcl-2家族蛋白调控细胞凋亡的机制，对于Bcl-xL、Bax的抑制剂设计也有着重要意义。

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子，其中Bax在线粒体膜上形成通道，细胞色素c经通道转移至线粒体膜外、诱导细胞凋亡，而Bcl-xL抑制Bax膜通道的形成。采用单分子荧光技术，我们研究了Bcl-xL、Bax、tBid的相互作用、构象变化和聚集行为。我们发现：tBid按照一定的化学计量比结合Bax，被tBid激活后的Bax在膜上倾向于形成四聚体，而tBid的BH3区域是激活Bax的主要结构元件。激活后的Bax在膜上形成通道至少要经历两个步骤：一，Bax在膜上形成聚集体；二，Bax聚集体插入磷脂膜中。这两个步骤相对独立，且Bax聚集体的形成先于Bax蛋白插膜。Bax插膜过程与磷脂膜的成分有关，线粒体外膜中的心磷脂成分能够有效促进Bax插膜。而Bcl-xL能将膜上的Bax转移回溶液中，抑制Bax膜通道的形成。另外，我们还发现，神经保护因子humanin（HN）能够在溶液或磷脂膜上与Bax、tBid结合，抑制Bax、tBid之间的相互作用，阻止tBid在膜上的聚集及对Bax的招募，从而抑制Bax的聚集和膜通道的形成。通过该课题研究，我们在单分子层面进一步阐明了Bax膜通道的形成机制、揭示了tBid、Bcl-xL在Bax膜通道形成过程中的作用以及HN如何通过抑制Bax膜通道的形成而行使其神经保护功能。此外，通过该课题我们还可辨识Bax膜通道形成过程中重要的蛋白-蛋白相互作用，这对于寻找可作为药物分子设计靶标的相互作用以调节细胞凋亡也具有重要意义。