鲟鱼精子质量蛋白标志物的筛选与功能研究

As one of the most ancient vertebrates on Earth, most of the sturgeon species are endangered. Establishment of germplasm bank, artificial propagation on sturgeons are of great significance for their resource conservation. Sperm quality plays a key role in the reproduction. But the avaliable methods for evaluating sperm quality are inadequate. And the internal reason for the differences of sperm quality has not been fully understood. Sperm are highly specialized cells, so the proteomic technology has a significant advantage on screening the biomarkers of sperm quality and revealing the physiological mechanisms of their express and regulation. In this study, the proteomic technology will be used to screen the biomarkers of sperm quality (sperm motility and fertility) in spermatozoa and seminal plasma of Amur sturgeon and Siberian sturgeon. Moreover, those biomarkers will be verified in Dabry’s sturgeon. The expression characteristics and related mechanism will be studied by cloning and expression, preparation of antibody, immunohistochemistry and Western Blotting technologies, associated with bioinformatics approaches. The results will help to screen good-quality fish sperm effectively, as well as provide theoretical basis for the establishment of germplasm bank in sturgeon.

作为地球上最古老的脊椎动物之一，大部分鲟鱼物种已濒临灭绝。建立种质资源库、开展人工繁殖对保护鲟鱼自然资源具有重大意义。在鲟鱼人工繁殖过程中，精子质量是直接影响其繁殖效率的关键因素。现有的精子质量评价方法不够完善，并且影响精子质量差异的内在机制尚未清楚。精子是高度特化的细胞，蛋白质组学技术在寻找精子质量相关的生物标志物进而揭示其表达调控机制方面具有显著优势。本项目拟使用蛋白质组学技术在施氏鲟和西伯利亚鲟的精浆及精子中筛选出与精子质量（活力和受精率）相关的蛋白标志物，进一步在达氏鲟上验证其有效性，即通过基因克隆、表达及相应抗体的制备，运用免疫组织化学和免疫印迹技术研究其表达特性，并结合生物信息学手段阐述其影响精子质量潜在的分子机理。该研究成果可以为有效筛选高质量的鲟鱼精子提供技术支持，并为建立其种质资源库提供理论依据。

作为地球上最古老的脊椎动物之一，大部分鲟鱼物种已濒临灭绝。建立种质资源库、开展人工繁殖对保护鲟鱼自然资源具有重大意义。在鲟鱼人工繁殖过程中，精子质量是直接影响其繁殖效率的关键因素。精子是高度特化的细胞，蛋白质组学技术在寻找精子质量相关的生物标志物进而揭示其表达调控机制方面具有显著优势。本项目首先采用iTRAQ蛋白质组学技术在施氏鲟和西伯利亚鲟中分别筛选出359和291个与精子质量相关的差异表达蛋白，其中72个蛋白属于两个物种共同差异表达的分子标志物。进一步通过生物信息学手段分析数据显示与鲟鱼精子质量相关的蛋白主要位于线粒体内，参与能量代谢及氧化还原反应，信号通路主要有Arginine and proline metabolism, Citrate cycle (TCA cycle) 和 Pyruvate metabolism。结果说明低质量精子表达的与能量代谢相关的蛋白相对较低，从而影响精子产生与精子活力和受精所需要的能量，进而导致精子活力和受精能力下降。另外低质量精子中的抗氧化酶、分子伴侣以及膜结合蛋白等的相对表达量也较低，这些蛋白都将成为潜在的与鲟鱼精子质量相关的蛋白标记物。在达氏鲟上，我们通过2D-MS蛋白质组学技术共筛选出313个与精子质量相关的差异表达蛋白，其中挑选出50个做进一步的质谱鉴定及功能分析，结果显示这些蛋白主要参与能量代谢、精子运动和应激反应。针对三种鲟鱼精子质量相关表达差异蛋白质CKMT1A、LDHB和MDH2进行WB验证，其结果与蛋白质组学鉴定结果一致。我们还从精子质量相关蛋白标志物中挑选了与应急反应相关的蛋白热休克蛋白HSP90和HSP70进行基因的克隆，得到基因全长序列，为后续蛋白表达、抗体制备和功能验证，以及最终为探讨热休克蛋白家族与精子质量之间的关系打下基础。此外，本项目还成功将ENO3和PMCA2两个蛋白用于鲟鱼精液冷冻保存后精子质量评价中，结果证明两个蛋白分别与精子质膜完整率和精子活力呈显著正相关，可以作为评价鲟鱼精子质量相关的分子标志物。该研究成果可以为有效筛选高质量的鲟鱼精子提供技术支持，并为建立其种质资源库提供理论依据。