果蔬中超痕量农药残留免疫毒性效应的体外高通量评估及联合效应机制初探

Multiple pesticide residues in fruit and vegetable products in China posed a serious potential threat to the quality and safety of ago-products. However, there was rare currently the estimation of combined toxicity on mixed pesticide residues in China due to the less application of pesticide residue. In the present research, we aim to evaluate the combined toxicity of three kinds of pesticides with potential immunotoxicity simultaneous residue in fruit and vegetables products. Based on immune cell responses in vitro and verify the process of mutual combination, immune cell responses to the mixed pesticides were detected by modern cytotoxicology testing techniques and ELISA and QRT-PCR，to establish the evaluation system of the combined toxicity effect of pesticides based on the cellular immune toxicity index, and clarify the toxicity effect of common pesticides, evaluating the degree of joint toxicity risk of multi pesticide residues. The implementation of this project can not only provides a new research method to evaluate the harm of pesticide residues and theoretical reference for construction of pesticide exposure groups, but also plays a positive role in guiding the rational use of pesticides in production and the preparation of pesticide residue limits.

针对我国果蔬产品中农药残留混合污染普遍且联合毒性风险不明的现状，本研究拟以农产品中混合存在且检出率较高的毒死蜱、高效氯氰菊酯和代森锰锌为研究对象，以体外培养的人源免疫细胞为受试对象，运用体外细胞毒理实验、荧光激活流式细胞分选术、ELISA和定量反转录PCR等技术，在亚细胞、胞内酶分子、mRNA及蛋白表达水平上，针对具有免疫细胞特点的细胞表面抗原亚群、NK细胞活性等毒性终点进行重点分析，构建以细胞免疫毒性指标为基础的农药联合毒性效应评价体系，明确常见农药的免疾毒性效应，评估农药多残留的联合毒性效应的风险程度，并通过动物毒理学实验加以验证。在此基础上初步探索多残留导致的联合免疫毒性效应的相互作用方式及可能的作用机制。本项目的实施不仅能够给评估农药多残留的危害程度提供新的研究方法，为构建农药残留暴露组提供理论参考，而且对指导生产中农药的合理使用和制修订农药残留限量等方面起到积极作用。

我国农产品中农药残留混合污染现象极为普遍，但由于缺乏充足的科学依据，尚未制定单一农产品中农药多残留的限量标准，成为影响我国农产品质量安全的重要潜在风险隐患。本项目针对以上问题，以农产品中共同检出率较高的毒死蜱、高效氯氰菊酯和代森锰锌为代表，以T淋巴细胞和巨噬细胞为受试对象，开展了不同种类和剂量的农药对免疫细胞的单一或联合毒理学实验，重点分析了具有免疫细胞特点的细胞表面抗原亚群、细胞内钙离子浓度、酸性酯酶活性、氧化损伤指标和细胞炎性因子等亚细胞水平上的毒性效应终点，评估了每种农药的免疫毒性效应，明确了联合毒性作用的类型，为了使研究更有系统性，项目还借助基于核磁共振检测技术考察了代表性农药对模式生物小鼠内源性代谢物的影响，主要取得以下结果：（1）在较低暴露剂量下（半致死浓度的1/103.5-1/102）毒死蜱、高效氯氰菊酯和代森锰锌都表现出较强的免疫毒性，具体体现在抑制CD4+抗原T淋巴细胞的形成，干扰正常淋巴细胞分化，引起胞浆内钙离子浓度增加，抑制T淋巴细胞内的非特异性酯酶活性，促进巨噬细胞LDH释放、诱导细胞内积累ROS和改变SOD酶活性，干扰巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子和白细胞介素 IL-1β等细胞因子，破坏机体固有性性免疫应答机制；（2）单一或混合农药暴露实验证实，在等毒性比的基础上，毒死蜱和高效氯氰菊酯仍比代森锰锌表现出更强的免疫毒性效应，二元或三元农药混合暴露在24h、48h和72h的相加指数范围为1.89-3.72，联合作用表现出不同程度的协同作用，且随着暴露时间的延长，协同作用也逐渐增强，说明以上农药长期共同暴露时风险性会急剧上升；（3）基于NMR的代谢组学分析结果显示小鼠经不同浓度的乙螨唑暴露 14 d 后，与对照组相比，各处理的大部分内源物浓度均有所下降，且下降幅度与暴露浓度呈正相关，鉴定出精氨酸等14种内源性代谢物有显著变化，三甲胺-N-氧化物被认为是农药处理后的特征性生物标志物。本研究对正确评估农药多残留带来的健康风险具有重要的现实意义。