β-葡聚糖受体Dectin-1及其Raf-1信号通路诱导抗肿瘤免疫应答机制的研究

富含β-葡聚糖的真菌多糖药物作为免疫调节剂已用于肿瘤临床治疗，国外学者及我们的研究表明Dectin-1是识别β-葡聚糖的关键受体，但Dectin-1及其信号传导通路在β-葡聚糖诱导的T细胞介导的抗肿瘤免疫应答中的作用及机制尚未明确。本研究将探讨作为联系固有和获得性免疫应答纽带的单核巨噬细胞、树突状细胞通过所表达的Dectin-1识别β-葡聚糖后，能否激活Raf-1信号通路，通过磷酸化和乙酰化，上调NF-κB p65转录活性，促进IL-12p70蛋白分泌，诱发T淋巴细胞极化形成Th1应答，最终诱导CD8+ T细胞形成抗肿瘤细胞的CTL应答。并检测激活的CTL细胞体外对胃癌、结直肠癌细胞的杀伤活性。这将为临床应用β-葡聚糖这一低毒副作用的天然高分子聚合物作为一种肿瘤免疫治疗手段提供理论依据。

探讨β-葡聚糖（Curdlan）诱导人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞系）细胞产生炎症因子的机制。实时荧光定量PCR分析TNF-α、IL-6的mRNA表达水平。酶联免疫吸附法检测培养上清液中细胞因子分泌量。免疫印迹法分析NF-κB抑制蛋白（IκBα）和磷酸化IκBα、p38MAPK、ERK1/2磷酸化水平。共聚焦显微镜检测NF-κBp65细胞核内转位。流式细胞检测细胞膜上Dectin-1表达。结果表明β-葡聚糖刺激THP-1细胞后，TNF-α、IL-6 mRNA水平升高呈现时间依赖效应；β-葡聚糖上调TNF-α、IL-6 mRNA水平为剂量依赖效应。β-葡聚糖刺激THP-1细胞后24h，TNF-α、IL-6蛋白水平显著升高，呈剂量依赖效应。β-葡聚糖作用THP-1细胞后60、120min，IκBα磷酸化水平上升显著升高，而IκBα蛋白水平相应降低；磷酸化p38MARK、ERK1/2显著升高；细胞核内转位的NF-κBp65的水平明显升高。NF-κB、MAPKs抑制剂地塞米松处理THP-1细胞再予β-葡聚糖刺激，其TNF-α、IL-6 mRNA水平明显低于β-葡聚糖单独刺激组。Curdlan上调细胞膜上Dectin-1表达量，呈效应-时间依赖方式。研究结果提示β-葡聚糖诱导THP-1细胞产生炎症因子是依赖Dectin-1及下游信号通路NF-κB、MAPKs。.本研究探讨香菇多糖（LNT）对人THP-1细胞产生IL-12的影响，发现LNT能上调IL-12p35和p40两个亚基的mRNA表达，并呈时间-效应方式；LNT显著促进IL-12的分泌，呈现剂量依赖方式。.我们发现白念珠菌细胞壁不溶性β-葡聚糖（CaIG）可通过与人角质形成细胞（KC）表达的识别受体Dectin-1结合后，在mRNA 水平和蛋白水平上调IL-1β、IL-6的表达和分泌，并呈现时间依赖效应和剂量依赖效应。CaIG激活的KC细胞可通过分泌的IL-1β、 IL-6诱导CCR6+ T cells产生IL-17。.探讨人中性粒细胞能否通过C型凝集素1（Dectin-1）识别CaIG来介导体外杀伤白念珠菌的活性。结果表明β葡聚糖刺激中性粒细胞后明显上调H2O2浓度，呈时间依赖效应。CaIG能上调中性粒细胞杀伤活性。提示Dectin-1参与人中性粒细胞分泌H2O2以及对白念珠菌杀灭活性。