利用冷冻电镜研究Rad51介导的DNA同源重组机制

Homologous recombination (HR) can repair DNA damage, prevents the demise of damaged DNA replication forks, orchestrates the segregation of homologous chromosomes in meiosis I and functions in telomere maintenance, playing an important role in maintaining the integrity, stability and diversity of biological gene. HR is a highly intricate and precisely regulated process involving a large number of proteins and complexes. Among these, a family of conserved recombinases catalyze ATP-dependent pairing and strand exchange between homologous DNA molecules. There are two distinct recombinases functions in eukaryotic mitosis and meiosis. Rad51 recombinase is essential for both mitotic and meiotic recombination while Dmc1 is meiosis-specific recombinase. HR dysfunction or deficiency would lead to many serious problems, including cancer, infertility and developmental problems. Given the link to cancer, research on the mechanism and regulation of HR has received increasing attention. This project plans to resolve the high-resolution structure of the synaptic intermediate state of Rad51-mediated homologous recombination by cryo-EM. Meanwhile we will investigate the regulatory mechanisms of small molecules and regulatory proteins on Rad51-mediated HR, which would provide an important basis for understanding the structure of homologous recombination in eukaryotes and may promote Rad51-related drug research and development.

同源重组能够修复DNA损伤及受损复制叉，在减数分裂中帮助同源染色体分离，对于端粒的维持也具有重要作用，在维持基因完整性、稳定性及多样性等方面发挥着重要功能。同源重组是一个有多种蛋白及复合体参与的极度复杂且精细调控的过程，其中最重要的是高度保守的重组酶家族，能够催化同源DNA发生链交换。真核生物有丝分裂及减数分裂中分别由不同的重组酶参与，有丝分裂中为Rad51，而减数分裂中则是Rad51与Dmc1协同发挥功能。同源重组的紊乱将会导致许多严重问题，如癌症发生，不孕不育及发育问题等，因此关于高度保守重组酶家族的结构研究一直是一个热点话题。本项目将利用冷冻电镜技术对Rad51参与同源重组形成synaptic中间态进行高分辨结构研究，同时对不同小分子及蛋白调控因子对Rad51作用机制进行研究，进而为理解真核生物中Rad51介导的同源重组工作机制提供重要结构基础，并可能促进Rad51相关的药物研发。

同源重组是细胞中DNA双链断裂的主要修复方式。同源重组的核心步骤为重组酶催化的DNA链交换。真核生物细胞中同时存在有两种重组酶，Rad51和Dmc1，它们能够在不同的细胞中，或者不同的细胞周期中催化DNA链交换的发生。Rad51主要负责体细胞有丝分裂或减数分裂时的同源重组，以保证基因组的完整性，而Dmc1主要在生殖细胞减数分裂时重组父母同源染色体，以实现适当的遗传和染色体分离。虽然Rad51和Dmc1是高度同源的，而且多种辅助蛋白调控着Rad51和Dmc1的重组酶活性，但这两种蛋白在DNA序列同源性上具有本质上不同的链搜索和链交换活性。Rad51不允许任何不匹配的链进行交换，而Dmc1可以容忍多个不匹配的DNA碱基对。为了揭示错配耐受机制的不同，我们利用冷冻电镜(cryo-em)分别对人源RAD51 (hRAD51)和酵母Dmc1 (ScDmc1)与单链和双链DNA形成的复合物进行了结构解析，并获得了近原子分辨率的结构模型。通过结构比对发现这两种蛋白质主要的构象差异位于负责与DNA底物相互作用的Loop2区域。我们进一步结合分子动力学模拟和单分子荧光共振能量转移实验发现了两个对DNA序列不匹配容忍度区别发挥至关重要重要的两个氨基酸残留，它们分别是人源RAD51 Loop2区域的V273 和D274 ,对应于人源Dmc1为P274和G275,因为将两个氨基酸交换之后足以将两种蛋白质对DNA错配的容忍度及交换效率发生改变。这一同源重组的精确控制机制对于揭示Rad51和Dmc1在DNA双链断裂修复中的作用具有重要意义，并为同源重组在有丝分裂和减数分裂中的调控机制提供了重要信息。