miRNA194与SPRR2a竞争性调控Zeb2信号转导及抑制肝纤维化的机制研究

Exploring the mechanisms of non-coding gene and the target in regulating liver fibrosis make sense. Recently, we showed that the expression of small proline rich Protein 2a (SPRR2a) was down-regulated in hepatic stellate cell (HSC) activation, while SPRR2a could suppress the expression of miNRA194. Possibly, both of SPRR2a and miRNA194 can competitively regulate the phenotype of HSC through Zeb2. Firstly, we survey the correlation ship between SPRR2a, miRNA194 and clinical prognostic factor of liver fibrosis patients. Then we down and up-regulated SPRR2a and miRNA194 in HSC by siRNA silencing and plasmid over-expression technologies, to clarify the impact of SPRR2a and miRNA194 on HSC phenotype and Zeb2/Akt signal transduction. Finally, we use lentivirus to up-regulated SPRR2a and/or down-regulated miRNA194 in CCl4 induced rat liver fibrosis models, to reveal the effect of SRPP2a and miRNA194 on liver fibrosis outcome. The study is designed to clarify that SPPR2a-miRNA194 can maintain HSC quiescent phenotype by targeting Zeb2/Akt signal transduction, and to reveal the protective mechanism of SPRR2a-miRNA194 in reversing liver fibrosis. This study provides a theoretical and experimental basis for clinical treatment in liver fibrosis.

探索非编码基因及其靶基因调控肝纤维化的机制具有重要意义。我们前期实验发现肝星状细胞（HSC）活化过程中小富含脯氨酸蛋白2a（SPRR2a）下调，而SPRR2a可抑制miRNA194表达，二者可能竞争性调控下游Zeb2分子而影响HSC表型。本课题首先观察乙肝肝纤维化患者肝组织及血清中SPRR2a-miRNA194的表达，并分析其与预后因素的关联。随后在细胞学水平采用siRNA干扰和质粒过表达技术下调和上调HSC中SPRR2a和miRNA194的表达，阐述二者对HSC表型及Zeb2/Akt信号通路的调控作用。最后采用尾静脉注射包装过表达SPRR2a和沉默miRNA194的慢病毒载体干预大鼠四氯化碳肝纤维化模型，探索二者对肝纤维化转归的影响。研究结果有助于阐明SPRR2a-miRNA194靶向调控Zeb2/Akt信号通路维持HSC非活化表型和逆转肝纤维化的机制，为临床治疗肝纤维化提供理论依据。

慢性肝脏疾病随着疾病的发展，会导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的发生。狭义的抗纤维化治疗是指抑制肝脏细胞外基质（ECM）生产和促进其降解吸收，迄今为止临床上还没有明确有效的狭义抗肝纤维化药物。肝星状细胞（HSCs）的活化是肝纤维化发生和发展的关键事件。研究证实microRNA-194（miR-194）的水平在活化的HSCs中显著下降，但miR-194在肝纤维化进展中的实际作用尚不清楚。本研究的目的是探讨miR-194介导肝纤维化的体内外调节作用及其机制。首先我们通过细胞实验证实在小鼠和患者的HSCs细胞中，miR-194都明显下调。第二部分研究中我们给小鼠转染高表达或抑制miR-194的pHSCs，观察HSCs活化指标Col I和α-SMA的表达水平，证明miR-194可抑制HSCs的活化。第三部分研究采用过表达或抑制miR-194来观察miR-194对HSCs细胞增殖周期的影响，证明miR-194通过抑制细胞周期蛋白D1的表达，引起G0/G1期细胞周期停滞而抑制HSC的增殖。第四部分研究探索了miR-194影响HSCs活化的信号通路，确定AKT2（AKT丝氨酸/苏氨酸激酶2）基因作为研究靶点。我们在人肝星形细胞（LX2细胞）中敲除AKT2（si- AKT2），用过表达或抑制的miR-194进行处理，证明miR-194至少部分通过抑制AKT2的表达而抑制了细胞的活化和增殖。最后一部分研究采用CCl4小鼠肝纤维化模型，给小鼠重新导入miR-194，观察是否可以改善肝纤维化。与对照组小鼠相比，组织学显示miR-194改善了肝脏炎症和纤维化，免疫组化结果显示α-SMA阳性细胞百分率明显降低，Westernblot显示小鼠肝脏中α-SMA、cyclin D1和AKT2/p-AKT2蛋白水平显著降低，说明miR-194在一定程度上减轻了小鼠肝纤维化的进展。.本研究从多角度证实了miR-194在活化的HSCs中下调，并探明其通过抑制AKT2抑制HSCs的活化和增殖。动物实验表明miR-194的重新导入对肝纤维化起到保护作用。这项研究为miR-194通过减少AKT2在减轻肝纤维化中的作用提供了线索。对肝脏疾病患者导入miR-194可能是预防或治疗肝硬化的一种有效途径。