Notch信号活化介导的内耳支持细胞年轻化与毛细胞再生的研究

Notch signaling pathway is cruial during the development process of inner ear which plays multiple roles involved in including proliferation, cell fate determination and differentiation of progenitor cells. Based on previous reports and our preliminary data that Notch signaling activation induced sox2+ supporting cells(SCs) proliferation in mouse injury utricle model in vivo, we presumed that Notch signaling activation may mediates rejuvenation of inner ear SCs which might allow SCs regain the potential to generate new hair cells in postnatal cochlea and mature utricle. This study will verify this hypothesis by observing the protein marker changes，survival, proliferation and differentiation of Sox2+ SCs after Notch signaling activation based on a hair cell injury model established by Pou4f3DTR/+ transgenic mice. For further exploration, Atoh1 and Espn gene will be co-regulated to induce mitotic regeneration of hair cells derived from rejuvenated SCs. Morphology and function of new hair cells will be evaluated to confirm our hypothesis. Hopefully, this research will provide new sight to mammalian inner hair cells regeneration.

Notch信号通路在发育过程中通过侧抑制和侧兴奋在内耳感觉上皮前体细胞的增殖和命运决定中发挥重要的作用。结合文献资料和基于成年小鼠在体椭圆囊损伤模型Notch信号激活后可以诱导Sox2阳性支持细胞增殖的前期结果，我们认为Notch信号通路活化能诱导Sox2阳性支持细胞年轻化，重新获得向毛细胞分化的潜能。本研究将以Pou4f3DTR/+转基因小鼠建立P7耳蜗和P30椭圆囊毛细胞损伤动物模型为基础对该假设进行验证，研究Notch信号通路活化状态下，观察Sox2阳性支持细胞的蛋白标记物表达、增殖情况及增殖后存活和向毛细胞分化的情况；在此基础上，引入Atoh1、Espn基因，研究在Notch信号活化介导支持细胞年轻化以后毛细胞的再生、成熟情况，并对新生毛细胞的超微结构、功能及听觉、平衡功能进行评估，为调控Notch信号通路促进哺乳动物内耳毛细胞再生和听觉平衡功能恢复提供理论和实验基础。

哺乳动物的听觉和前庭毛细胞损伤和缺失都是永久性的，虽然前庭细胞具有有限的自我再生能力，但是这种自我再生能力很弱，通过基因调控促进内耳毛细胞的再生从而实现听觉和平衡功能的恢复仍然是非常重要的课题。Notch信号通路在发育过程中通过侧抑制和侧兴奋在内耳感觉上皮前体细胞的增殖和命运决定中发挥重要的作用。本课题使用IDPN单次腹腔注射建立较为稳定的成年小鼠在体椭圆囊损伤模型前提下，使用转基因小鼠进行实验，通过圆窗给药的方式，在内耳局部活化Notch信号通路，结果发现在支持细胞感觉上皮也受到破坏的情况下，激活Notch信号通路可以促进成年小鼠在体损伤椭圆囊支持细胞增殖性再生。在活化Notch信号通路的基础上，再通过转基因小鼠调控或圆窗局部给予DAPT抑制Notch信号通路，结果发现，受损椭圆囊不仅Sox2+支持细胞增殖再生明显增加，还可以观察到分裂中的Myo7A+毛细胞以及增殖性再生的Myo7A+毛细胞。如果在活化Notch信号通路的基础上再在Sox2阳性细胞过表达Atoh1基因，结果发现在受损的椭圆囊上可以观察到大量Sox2阳性的支持细胞重新表达Atoh1，并能见到增殖的EdU+/Atoh1+/Sox2+细胞。这些结果说明在活化Notch信号基础上，双向调控Notch信号通路或激活Atoh1基因，都可以让成年小鼠在体损伤椭圆囊毛细胞实现再生。基本验证了课题最初的设想，为基因调控促进哺乳动物内耳听觉、平衡功能恢复奠定实验和理论基础。