盾叶薯蓣根状茎甾体皂苷转化分子机制研究

Dioscorea zingiberensis C.H.Wright, an endemic species of China, is the world's most important resource plants of steroidal saponins. According to the open or close state of F ring in the molecular structure of steroidal saponins, steroidal saponins are divided into two types, called furostanol glycosides and spirostanol glycosides. And these two types of steroidal saponins have a clear difference in their bioactivities. In plant, furostanol glycosides are enzymatically converted into the corresponding spirostanol glycosides during postharvest treatment and storage by furostanol glycoside 26-O-β-glucosidase (F26G). So far, little is known about the conversion mechanism from furostanol glycosides to spirostanol glycosides. It is still unknown about the molecular mechanisms of the steroidal saponins conversion in the rhizome of Dioscorea zingiberensis. Based on the current understanding and research status of this scientific issue, we aim to uncover the cellular, biochemical and molecular mechanisms. To this end, we will investigate the temporal and spatial subcellular localization and time course of furostanol glycosidesm, spirostanol glycosides and F26G in rhizomes drying process by constructing overexpression, antisense expression and RNAi plants. After that, we will determine the key functional residues of F26G with the method of Alanine Scanning Mutagenesis. The accomplishment of this project will elucidate the molecular mechanisms of the conversion from furostanol glycosides to spirostanol glycosides in the rhizome of Dioscorea zingiberensis, and will make directional regulation of steroid saponins synthesis and accumulation possible. Obviously, our expected outcomes should be important for both science and practice.

盾叶薯蓣是世界上最重要的甾体皂苷资源植物。依甾体皂苷分子结构中F环环合状态，将其分为呋甾皂苷与螺甾皂苷，二者生物活性相差炯异。呋甾皂苷普遍存在于含甾体皂苷植物体内，在采后干燥、贮存过程中，呋甾皂苷在F26G酶解作用下，转化为相应的螺甾皂苷。迄今，关于甾体皂苷转化机制研究报道不多，盾叶薯蓣根状茎甾体皂苷转化分子机制仍为空白。基于对这一科学问题的认识现状和工作基础，拟通过构建盾叶薯蓣DzF26G基因过表达、反义表达及RNAi工程株，研究根状茎干燥过程中呋甾皂苷、螺甾皂苷与F26G变化时间进程与亚细胞分布变化；采用丙氨酸扫描定点突变方法，确定F26G关键功能残基，揭示F26G酶与呋甾皂苷作用的细胞、生化与分子生物学机制，阐明盾叶薯蓣根状茎甾体皂苷转化分子机制，使定向调控盾叶薯蓣根状茎甾体皂苷的合成与积累成为可能。项目预期成果具有重要学术价值和实践意义。

甾体皂苷是薯蓣属植物的主要活性成分，具有广泛的药理作用，而其生物活性与化学结构关系密切。呋甾皂苷26-O-β-葡萄糖苷酶（F26G）能催化呋甾烷型皂苷转化为螺甾烷型皂苷，是甾体皂苷生物合成和转化过程中的关键酶。研究盾叶薯蓣中甾体皂苷生物合成及转化过程中的关键代谢酶与编码基因、代谢调控机理的，不仅可以阐明甾体皂苷的生物合成、转化和调控机理，还能为后续通过基因工程定向调控甾体皂苷的生物合成提供理论依据。.通过RT-PCR和RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了DzF26G基因的全长cDNA序列，ORF为1641 bp，编码547个氨基酸。通过原核表达获得大小约为60kDa的F26G融合蛋白，其体外具有催化水解呋甾烷型皂苷转化为螺甾烷型皂苷的活性。探究盾叶薯蓣DzF26G生长周期内在不同器官之间的表达差异以及与总皂苷含量变化之间的关系，发现DzF26G表达变化趋势跟皂苷含量变化趋势基本一致，主要在叶片中大量表达，然而DzF26G酶作用的底物主要在根状茎中积累，说明DzF26G酶可能受到了转录和翻译水平的共同调控。.根据F26G蛋白三级结构比对分析，预测出3个功能氨基酸：E242、E455和W427。因此我们突变这三个氨基酸并检测对蛋白功能的影响。三种突变体病毒转染昆虫细胞后，均成功表达出可溶性蛋白。以薯蓣皂苷或pNPG为底物，加入不同突变体细胞破碎后的上清进行反应，显示三种突变体对pNPG都没有酶活性，对薯蓣皂苷的酶活性显著下降。这可能是E242和E455为亲和/质子供体位点,W427位于结合口袋，功能氨基酸突变使酶结合底物能力降低。.本项目研究了盾叶薯蓣根状茎干燥过程中DzF26G酶活性、皂苷含量、DzF26G表达量变化之间的关系，证明了DzF26G酶参与了体内转化过程。另外，我们制备了DzF26G蛋白的多克隆抗体和薯蓣皂苷的单克隆抗体，进行了初步组织定位，发现酶和底物都定位于维管束和薄壁细胞中。亚细胞定位研究表明， F26G主要定位于细胞质中。我们推测盾叶薯蓣甾体皂苷积累于细胞液泡中，而DzF26G分布于细胞质中，当细胞环境发生变化（如干燥），细胞区室化破坏，酶和底物接触，发生了催化反应。