盾叶薯蓣质体薯蓣皂素的来源与形成机制研究

Dioscorea zingiberensis is the rich source of diosgenin which has received considerable attention because of its being a principal starting material in the steroidal hormone industry for over seven decades. Theoretically,diosgenin is currently believed to be derived from the mevalonate pathway (MVA), which is active in the cytosol. Our preliminary results showed a relatively high level of diosgenin accumulation in the plant plastids and there exists a possiblility that diosgenin is locally synthesized in the plant plastids. In this study, we will investigate: 1,the subcellular localization of diosgenin to analyze its distribution in the Dioscorea zingiberensis plant cells; 2,the metabolisms of diosgenin and its precursors to find out whether diosgenin is from intracellular transport and or the (patially or fully) de novo synthesis in plastids; 3,the subcellualr localization of two key enzymes, DzFPPS and DzCAS in MVA pathway putatively responsible for the diosgenin synthesis to clarify whether diosgenin is synthezied through MVA pathway or not. Our investigations will advance our understanding concerning the biosynthesis,transport and accumulation of diosgenin, and will eventually facilitate the production of Dioscorea zingiberensis.

薯蓣皂素作为合成甾体激素类药物的理想原料已经70多年了，但是目前关于薯蓣皂素的合成、运输与积累机制的研究一直不多。现有的理论推定认为，薯蓣皂素在植物细胞质中通过MVA途径合成。申请人在前期未发表的研究中发现，在盾叶薯蓣的质体中可以检测到特异性的薯蓣皂素免疫荧光信号，表明质体中有薯蓣皂素的积累并存在薯蓣皂素在质体中合成的可能性。为阐明质体薯蓣皂素来源问题，本项目拟开展以下三方面研究：（1）薯蓣皂素亚细胞定位分析，明确薯蓣皂素在盾叶薯蓣细胞内的分布；（2）质体薯蓣皂素及其前体物来源分析，明确质体薯蓣皂素是来源于胞内运输还是在质体内合成或者同时来源于二者；（3）薯蓣皂素MVA合成途径中DzFPP和DzCAS两个关键酶的亚细胞定位分析，明确盾叶薯蓣质体中存在薯蓣皂素MVA合成途径的可能性。开展本项研究将进一步推进我们对薯蓣皂素生物合成、运输与积累机制的理解，并为盾叶薯蓣的生产加工提供理论指导。

薯蓣皂素是合成甾体激素类药物的起始原料。盾叶薯蓣为我国特有种，其根状茎富含薯蓣皂素，是最理想的甾体激素药源植物。目前认为薯蓣皂素是在细胞质中通过甲羟戊酸（MVA）途径合成，而实验室前期免疫组化研究发现，在盾叶薯蓣叶片质体中存在薯蓣皂素免疫荧光信号，我们对此提出假设：质体有可能通过2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径参与了薯蓣皂素的形成。为验证这一设想，我们用MVA和MEP途径13C前体物饲喂盾叶薯蓣叶片，提取薯蓣皂素进行HPLC、NMR和MS检测，结果揭示两种处理后的样品中13C-薯蓣皂素水平均比未经处理的略微升高。这说明MEP可能参与了薯蓣皂素的合成，因此我们推测MEP途径合成了中间体异戊烯二磷酸IPP并运输至细胞质中，促进薯蓣皂素的合成。通过对薯蓣皂素合成通路的分析，我们克隆了4个关键酶基因DzHMGR、DzFPS、DzSQS、DzCAS，并进行了原核表达及亚细胞定位分析。结果表明，HMGR和SQS定位于内质网和高尔基体，FPS和CAS则分布在细胞质中，这说明薯蓣皂素的合成运输与内质网和高尔基体有着密切的联系，并最终储存在细胞质中。此外，我们建立了高效的诱导盾叶薯蓣愈伤组织体系，并能快速的再分化成完整植株，为转基因工程株的培育打下了良好基础。综合上述结果，本研究运用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学等方法和技术，深入分析了薯蓣皂素的来源与形成机制，为亚细胞水平的薯蓣皂素合成提供了新的思路与线索，合成通路关键酶基因功能研究，为利用基因工程手段培育优良的薯蓣皂素高产品种提供了重要理论依据。