AKR2A参与分选及定位叶绿体外被膜蛋白的结构基础

Chloroplasts are unique organelles that are responsible for photosynthesis. Although chloroplasts contain their own genome, the majority of chloroplast proteins are encoded by the nuclear genome. These proteins are transported to the chloroplasts after translation in the cytosol. Prior to targeting these proteins to the various compartments of the chloroplast, they must be correctly sorted in the cytosol and targeted to the chloroplast outer envelope membrane (OEM) .To date, it is not clear how these proteins are sorted and targeted to the chloroplasts. Recently, the cytosolic carrier protein AKR2A was identified, which plays important roles in sorting an targeting chloroplast OEM proteins. AKR2A, as a soluble cytosolic factor, can bind chloroplast OEM protein OEP7 and Toc33 containing TMD and CPR anchored signal. In addition, AKR2A facilitates the targeting of OEM protein to chloroplast, which exhibits chaperone activity and prevents chloroplast OEM protein aggregation. Structural analysis of AKR2A and complex between AKR2A and OEM proteins can help to study the specific sites and the way of AKR2A binding OEM proteins and reveal the molecular mechanism of outer chloroplast protein sorting and targeting, which is essential for understanding the chloroplast biogenesis, photosynthetic apparatus building and function realization as well as the origin and evolution of eukaryotes.

叶绿体是负责光合作用的细胞器。虽然叶绿体中含有自己的基因组，但其大多数蛋白质是由核基因组编码的。核基因编码的蛋白经翻译后修饰从细胞质转运到叶绿体。核编码蛋白正确定位到叶绿体各腔室之前，需要在细胞质内被正确分选并定位到叶绿体外被膜上。但到目前为止该方面的研究很少。最近研究发现AKR2A在参与分选及定位叶绿体外被膜蛋白方面起着重要的作用。AKR2A作为可溶性胞内分选因子，结合一类含有TMD及CPR锚定信号的外被膜蛋白OEP7及Toc33；此外，AKR2A具有分子伴侣作用，阻止外被膜蛋白聚集沉淀，增加其可溶性并促进其定位。本课题的目标是通过解析AKR2A及其与OEP7（Toc33）复合物的晶体结构，深入研究AKR2A参与分选及结合叶绿体外被膜蛋白的分子机制，这对于理解叶绿体蛋白的生物发生、光合细胞器的建成和功能的实现以及真核生物的起源和进化等都有十分重要的意义。

本项目主要研究内容: 1.拟南芥AKR2A蛋白不同截短体的体外表达纯化，晶体培养、筛选与优化及晶体结构解析。2.AKR2A(41-342)与OEP7(1-35)的复合物蛋白的共表达与纯化，晶体培养、筛选和优化。3. AKR2A在水稻与大豆中的同源蛋白与OEP7(1-35)的表达纯化与晶体筛选。4. 通过拟南芥AKR2A不同突变体及其与OEP7复合物蛋白的结合情况分析两者的结合方式与可能位点。.本项目的主要结果，关键数据及科学意义:首先，得到衍射分辨率为2.0Å的 AKR2A(211-342)片状晶体并成功解析了其晶体结构。结构显示该区段含有四个ankyrin repeat序列，每个ankyrin repeat序列是一对反向的α螺旋，每对反向α螺旋间是一段loop，四个ankyrin repeat序列折叠在一起形成类似“L”形状的一个结构。AKR2A(211-342)三维结构的解析对于研究AKR2A介导底物蛋白定位于叶绿体是十分重要的。其次，为得到AKR2A的及其与OEP7复合物蛋白的精细三维结构，完成了AKR2A(41-342)与OEP7蛋白的共表达纯化及晶体筛选与优化，培养得到的晶体通过解析同AKR2A(211-342）的结构，推测AKR2A(41-342)在晶体生长过程中发生了蛋白降解。第三，在AKR2A(41-342)的基础上做了不同位点的突变并检测其与OEP7(1-35)的结合能力以确定AKR2A与OEP7相互作用的位点及结合方式。利用Instability软件预测发现AKR2A(41-342)的177-179(EEE)位点及277-278(EK)位点可能是对蛋白稳定性比较关键的位点，这五个位点突变后AKR2A(41-342)M1M2仍与OEP7(1-35)结合。说明这些位点对于AKR2A与OEP7的结合不是必需的；此外，结果表明AKR2A的41-80区段对于AKR2A与OEP7的结合是很关键的。如果该段序列缺失，AKR2A与底物结合能力明显下降。通过突变这段区域的疏水氨基酸，检测表达蛋白还能否与底物结合，以此找到与底物结合关键的氨基酸位点。检测发现突变55位的I及56位点的L为S后，AKR2A不与OEP7相互作用，同时突变47位的F、49位的F与52位的M为S，AKR2A与OEP7的结合能力下降，所以推测这些氨基酸位点对于AKR2A与OEP结合是必需的。