叶绿体双精氨酸依赖转运途径底物分选调控机制研究

The twin-arginine translocation pathway (TAT) is essential in chloroplasts thylakoid membrane. Its main function in chloroplasts is to transport proteins across the thylakoid membrane to the lumen. However, the mechanisms of sorting the imported nuclear-encoded proteins to the Tat pathway remain largely unknown. Using yeast two-hybrid screen, we have identified an Arabidopsis protein, TCET1 (translocation factor connection envelope system and Tat pathway 1), which plays an essential role in the accumulation of the chloroplast Tat pathway substrate proteins. In addition, TCET1 protein was found to interact with the Tat pathway substrates. To further elucidate the TCET1 function, protein interaction assays will be applied to analyze the mode of its substrate recognition. Meanwhile, in vitro reconstitution and in vivo labeling will be carried out to explore its sorting mechanism through analysis of the interactions between TCET1 and up or downstream translocation factor. Finally, the effects of metabolic Ca2+ or redox state in stroma on the TCET1 localization, partition and interactions with substrate and other translocation factors will be examined to elucidate the regulatory mechanism. Our study will shed new insight into the mechanisms of chloroplast protein translocation and chloroplast biogenesis.

双精氨酸依赖转运途径是叶绿体类囊体膜上的重要转运途径。它的主要功能是协助底物蛋白跨过类囊体膜进入囊腔。叶绿体蛋白主要是核基因编码的,在细胞质合成后，通过叶绿体膜转运进入叶绿体，但进一步如何分选传递给双精氨酸依赖转运途径的尚不清楚。我们利用酵母双杂交发现了一个特异影响双精氨酸依赖转运途径底物累积的蛋白TCET1，同时研究发现TCET1与双精氨酸依赖转运途径的底物都相互作用，这表明TCET1可能是参与双精氨酸依赖转运途径的重要因子。为了进一步研究TCET1的功能，本项目利用蛋白互作方法研究TCET1如何识别底物；利用体外重组以及体内同位素标记追踪研究TCET1与上下游转运因子的相互关系从而揭示其分选机制；通过研究氧化还原与钙离子调控TCET1在叶绿体定位分布以及调控与底物及其它转运因子的结合来阐释分选的调控机制。本研究对于我们理解叶绿体蛋白转运机理和叶绿体生物发生机制具有重要意义。

正确运输并靶定叶绿体蛋白对叶绿体的生物合成至关重要。大多数叶绿体蛋白都是核基因编码的，这些核基因编码的叶绿体蛋白首先在细胞质中合成，合成之后需要通过位于叶绿体内外被膜的广谱性转运通道蛋白，之后在通过不同的类囊体膜转运途径靶定到类囊体膜上。然而叶绿体蛋白如何从广谱性的被膜转运途径精确分选靶定到特定的类囊体膜转运途径还知之甚少。在这里，我们通过研究保守的专一转运折叠蛋白的双精氨酸依赖转运途径来阐明这个问题。我们鉴定了两个具有ankyrin结构域的蛋白，SET1与SET2，这两个蛋白特异的分选靶定双精氨酸依赖途径的底物到类囊体膜。我们的研究结果显示SET1-SET2在体内体外形成一个异源二聚体，并且这个异源二聚体的形成对底物识别、折叠以及正确靶定都至关重要。进一步的研究发现破坏SET1-SET2复合物与Tat受体复合物组分Hcf106的相互作用，将阻断底物靶定到类囊体膜，从而影响叶绿体的生物合成以及光合作用功能。我们的这一工作揭示了叶绿体蛋白转运的新颖的机制，即为了保证叶绿体的生物合成以及底物正确运输，叶绿体招募了一个独特的分子伴侣复合物来行驶转运功能。