热休克蛋白90基因在斑节对虾卵巢发育中的作用分析

斑节对虾（Penaeus monodon）是我国和东南亚地区重要的海水养殖种类之一，在其苗种培育过程中，雌虾催熟一直采用眼柄切除法，但这种方法不利于重复使用，且有时会引起很高的死亡率。因此寻求更好的人工可控催熟新方法是有待解决的关键问题之一。.由于热休克蛋白90（Hsp90）基因功能广泛，而且在细胞内的含量较高，易获得大量的体外重组蛋白，而且我们在克隆斑节对虾Hsp90基因时初步发现其与卵巢发育有一定的联系，因此，我们利用已经克隆到的斑节对虾热休克蛋白90基因，研究卵巢发育相关基因的组织特异性表达和时序表达，探讨其表达过程及其调控机制，揭示该基因在斑节对虾卵巢发育和繁殖过程中的作用机理；构建原核或真核细胞表达载体，优化体外表达条件和各种参数，纯化回收表达产物，制作相应重组蛋白的多克隆或单克隆抗体，研究其对卵巢发育的激活或抑制效应，探讨其在斑节对虾雌虾催熟技术中的适用性。

本项目以斑节对虾为研究对象，通过构建的卵巢cDNA文库，采用EST、RACE等技术筛选得到HSP90及其分子伴侣蛋白CDC37、靶蛋白PLK1全表达序列、细胞周期蛋白B及其调控相关基因cyclin H、cyclin E、cyclin Y、Cyclin T、Cyclin C等基因的全表达序列。利用生物学软件分析了基因的结构特征，确定了所克隆的基因的同源性，保证克隆的真实性。利用实时定量PCR技术和免疫组化方法分析了这些基因的表达特征，了解基因在卵巢发育中的作用。结果表明基因在卵巢中的表达量相对高于其他组织，而且在卵巢发育的不同时期表达量存在较大差异，而且在卵巢发育的关键时期表达量较高，说明基因可能参与了卵巢发育。免疫组织化学结果显示，cyclin B蛋白在卵巢不同发育时期的亚细胞定位区别很大，卵巢发育开始时位于细胞核内，发育时位于细胞核及细胞质内，而发育结束时位于细胞质内，说明蛋白在卵巢不同时期所起的作用会有所不同。MIH处理和眼柄切除后，Hsp90基因在卵巢中的表达出现了明显的变化。从以上研究结果可以看出HSP90基因不但参与了卵巢发育的调控网络，而且还在不同发育时期内发挥着重要的作用。研究结果不但丰富了斑节对虾卵巢发育的分子调控机制研究的内容，而且对深入了解卵巢发育分子调控机理提供了理论依据。