蛋白质双末端肽的标记定量和新蛋白的发现研究

蛋白质双末端的氨基酸序列对于绝大多数蛋白具有唯一性。本项目通过蛋白双末端肽标记新技术，研究探索蛋白质的发现、鉴定、确认以及准确定量的新方法，发现一批新的未曾鉴定蛋白质。首先，研究筛选一系列荧光标记探针分子，选出对质谱电离效率和对串级谱解析没有影响的荧光标记分子；进而研究标记蛋白的固相酶解新技术、标记肽与非标记肽高效纯化技术，得到高纯度的双末端肽标记肽样品。末端标记肽经过多维高效液相色谱充分分离和激光诱导荧光准确测定得到浓度含量信息；通过串级质谱鉴定得到末端肽的所指向的蛋白质，从中发现未知蛋白。蛋白质双末端肽定量能够对蛋白质的浓度含量得到双重确认，准确性大幅提高，采用荧光标记，使得蛋白质定量检测灵敏度也得到大幅提高。因此，蛋白质双末端肽段的定量与鉴定具有特别重要的学术意义，为未知蛋白和低丰度的生物标志物的发现提供新的研究方法和技术途径。

项目针对蛋白质的双末端肽进行了标记、定量和新蛋白的发现等新方法研究。在标记方面，发展建立了FLAQ（Fluorescence Labeling Absolute Quantification）荧光标记蛋白质绝对定量新方法。该方法能够实现定量标记，标记肽段不影响串级质谱的鉴定，经过标准肽和实际样品验证了方法的准确性。同时，还发展了复杂的血浆蛋白质组分的染色标记定量新方法，并采用自主建立的阵列多维液相色谱系统分离鉴定了1474个血浆蛋白质。.鉴定蛋白质末端序列与修饰对于确定蛋白质的生物功能和相互作用具有重要意义。研究发展了末端肽选择性提取新方法。采用2种固相新材料固定非末端肽，一次去除所有非末端肽技术方法，通过三氟甲磺酸基团功能材料将非末端肽段反应后分离出去，获得对应的末端肽。方法成功应用于鼠肝实际样品，共鉴定到122条乙酰化蛋白末端，和106条游离蛋白末端。发展的第二固相材料是基于巯基衍生和纳米金材料去除非末端肽的分离新方法。利用双甲基化对蛋白质中所有游离氨基进行蛋白质层面的封闭。酶解后，再用特劳特试剂对非末端肽进行快速巯基衍生，继而使用纳米金材料对巯基衍生的非末端肽进行完全清除，得到蛋白质的末端肽段。鼠肝实际样品分析表明，该方法可鉴定到632蛋白末端肽。.研究发展了蛋白质共价结合固定化技术及其在新蛋白发现方面的新技术方法。研制了三氟乙磺酸基团修饰的多孔高分子聚合物，实现了对膜蛋白的共价固定和原位酶解。样品中的增溶剂、磷脂等可通过洗涤以及磁性分离被彻底除去。蛋白在材料表面形成蛋白质单分子层，能够被更完全地酶解。实验表明，从小鼠肝脏膜蛋白提取馏分中，共鉴定出5936中蛋白质，其中2946种为膜蛋白。通过对比Peptideatlas数据库，发现了735种未被鉴定过的蛋白质，可能为新发现蛋白。.发现了激光特异酶解获得末端肽新技术，将其用于糖化血红蛋白大规模、高通量的测定与定量，有望用于糖尿病临床快速高通量筛查。同时，还研究发展了100个活细胞蛋白质组的超高灵敏度分离鉴定新技术装置（iPAD-100）。首次实现了100细胞蛋白质组的超灵敏度分析。DLD细胞蛋白质组能够鉴定813个蛋白质，最低含量达到200zmol。在临床医学和生命过程分析，如循环肿瘤细胞、干细胞等稀有细胞的蛋白质组分析与比较等方面具有主要应用前景。