基于抗体库和蛋白质谱分析发现新的白血病耐药相关膜蛋白

耐药是白血病化疗失败和复发的主要原因，目前临床预测白血病患者耐药的检测指标明显不足，且没有一次检测多个耐药相关指标的方法。我们以人白血病细胞系HL60及其阿霉素耐药株HL60/ADR为抗原，分别建立了抗HL60和抗HL60/ADR的抗体库，从中筛选出51株差异识别HL60和HL60/ADR的抗体，发现部分抗体具有改变HL60和HL60/ADR对药物敏感性的作用，并鉴定出新的细胞膜蛋白。本项目进一步鉴定差异抗体识别的膜蛋白，研究上调/下调这些差异表达的膜蛋白后，HL60和HL60/ADR细胞对药物敏感性的变化，同时研究白血病细胞内药物浓度和细胞周期、细胞凋亡、细胞粘附及其相关基因的变化，以阐明这些差异表达膜蛋白介导白血病细胞耐药的机理。在此基础上，研究这些差异表达膜蛋白与临床白血病患者化疗疗效的关系，建立基于FACS的一次多因素分析白血病细胞，尤其是白血病干细胞耐药相关膜蛋白表达的新方法。

耐药是血液肿瘤化疗失败和复发的主要原因，与耐药相关的细胞膜蛋白是流式细胞仪检测和抗体靶向治疗的理想分子。我们以人白血病细胞系HL-60 及其阿霉素耐药株HL-60/ADR 为抗原，分别建立了抗HL-60 和抗HL-60/ADR 的抗体库，从中筛选出51 株差异识别HL-60 和HL-60/ADR 的抗体，比较HL-60/ADR和HL-60细胞经这些抗体处理后药物敏感性变化，发现一株与HL-60细胞结合明显高于HL-60/ADR的抗体5D12能改变细胞对药物的敏感性，并经免疫共沉淀、SDS-PAGE分离、蛋白质谱分析和siRNA干扰确证，鉴定5D12识别的靶抗原为易位表达于细胞膜的蛋白SFPQ，机制研究表明细胞膜SFPQ通过诱导细胞凋亡和减少细胞S期比例而抑制细胞增殖和克隆形成能力，从而维持HL60细胞对阿霉素的敏感性；同时我们以人白血病患者CD34+CD38-细胞为抗原，建立了抗人白血病患者CD34+CD38-细胞的抗体库，从中筛选出4株差异识别白血病患者CD34+CD38-细胞和正常人骨髓细胞的抗体，并证明其中一株抗体能显著抑制白血病患者细胞在小鼠体内的生长。我们分析了ABCB5在血液肿瘤细胞的表达，发现B-precursor ALL和AML中M1和M2亚型病人ABCB5表达水平明显升高，临床药物抗性的血液肿瘤病人ABCB5表达，而临床药物敏感的血液肿瘤病人ABCB5不表达，且ABCB5的表达与MDR1表达具有较好的相关性，而与MRP和BCRP表达无明显的相关性。构建了IL-3与LDM融合蛋白，证明其具有靶向杀伤CD123+肿瘤细胞的作用。设计了基于脐带间充质干细胞（HUMSCs）归巢和抗体特异性的治疗非霍奇金氏淋巴瘤的双重靶向系统，证明表达分泌scFvCD20-sTRAIL的HUMSCs 能显著抑制裸鼠皮下BJAB移植瘤生长。构建了以CD20为靶点、力达霉素为弹头药物的基因工程抗体，证明其对CD20+的淋巴瘤有很强的杀伤活性，尤其是对美罗华耐药的病人肿瘤细胞同样有效。构建了人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白，证明其与抗CD3/抗CD20微型双功能抗体联合能明显抑制裸鼠皮下Raji移植瘤的生长。设计了基于CD20启动子驱动stTRAIL表达的B-淋巴瘤基因治疗系统，证明BJAB细胞被基因修饰的腺病毒感染后能特异性表达分泌stTRAIL蛋白，并抑制其自身生长。