蛋白质组末端肽的深度覆盖定性和高准确度定量新技术研究

Development of novel techniques for the enrichment, separation, identification and quantification of protein terminal peptides with high specific sequence and important biological functions is of great promise to significantly reduce the complexity of proteome samples and realize the confident identification, accurate quantification and biological validation of low abundant proteins of biological importance. Hence, the aim of this project is to develop novel techniques for the deep-coverage identification and high accurate quantification of proteome terminal peptides. Firstly, develop novel method with high efficiency and selectivity which is capable of enriching N and C terminal peptide of proteome sample digested by various kinds of enzyme, improve the identification coverage of protein terminal peptides taking use of the complementarity of N and C terminal peptides generated by different enzyme; Secondly, develop continuous ion monitoring method for the identification of terminal peptides and utilize MS/MS fragment ions intensity as the abundance feature to improve the quantification accuracy for proteome terminal peptides; Thirdly, carry out affinity purification and biological validation for target proteins by using the protein terminal peptide as epitope to synthesize antibody with high specificity. Lastly, apply the above techniques to the proteome differential analysis and biological validation of human liver cancer cell lines with high and low metastatis rate, which will provide important support for the mechanism exploration and early diagnosis of cancer metastatis.

针对具有高度序列特异性和重要生物功能的蛋白质末端肽，在组学水平上发展富集、分离、鉴定和定量分析的新技术，有望显著降低蛋白质组样品的复杂度,实现对具有重要生物意义低丰度蛋白质的可信鉴定、准确定量和生物学验证。因此，本项目拟开展蛋白质组末端肽的深度覆盖定性和高准确度定量新技术研究。通过发展适合于多种酶切方式的高效和高选择性蛋白质组C末端和N末端肽富集方法，利用多酶酶解产生的不同末端肽以及C末端和N末端肽的互补性，提高鉴定覆盖率；通过对末端肽进行连续离子监测，以具有高特异性的二级质谱碎片离子强度为丰度特征，提高蛋白质组末端肽定量的准确度；以蛋白质末端肽为抗原决定基，合成高特异性的抗体，对目标蛋白质进行亲和富集和生物学验证。此外，还将上述新技术应用于人肝癌高低转移细胞株蛋白质组的差异分析和生物学验证，以期为揭示肿瘤转移机理和实现早期诊断提供重要技术支撑。

蛋白质的末端不仅是蛋白质合成的起点和终点，而且参与和调节了蛋白质复合体形成、蛋白膜整合、蛋白亚细胞器锚定等诸多生物过程。此外，蛋白质末端的研究还可以为揭示蛋白酶的作用机理提供重要信息。本项目针对蛋白质末端肽富集中存在的问题，发展了多种新型的蛋白质组末端肽富集、鉴定及定量策略。.为了提高蛋白质组C末端肽的鉴定覆盖度，利用羧肽酶酶切的高效高选择性，结合强阳离子交换对角线色谱，发展了一种适用于多种酶切方式的蛋白质C末端肽富集方法，并将该方法应用于大肠杆菌蛋白质C末端组的分析中。和富集前相比，蛋白原始C末端肽和neo-C末端肽的鉴定数目分别提高1倍和4.8倍；将该方法结合多种酶切方式，使C末端肽和neo-C末端肽的鉴定数目进一步提高了37%和60%。.针对传统蛋白质组N末端肽富集需要采用大量去除材料导致N末端肽回收率低，以及步骤繁琐、样品损失等问题，发展了一种基于疏水基团修饰的蛋白质N末端肽富集方法（HYTANE），可以在常规的样品除盐过程中对非N端肽段进行简便快速的去除。该方法具备很高的疏水基团标记（99%）和C18材料辅助去除（99%）效率。将其应用于酵母蛋白质N末端组的分析，和富集前相比，蛋白原始N末端肽和neo-N末端肽的鉴定数目分别提高1.6和4.8倍。与文献报道的方法相比，该方法具有更高的富集效率和选择性（99%），且对不同性质的N末端肽无歧视效应。.为了研究细胞凋亡过程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶—caspase的底物和作用位点，以化疗药物依托泊苷刺激Jurkat细胞为模型，采用基于疏水基团修饰的N末端肽富集策略，结合SILAC标记的定量技术，实现了对该过程中N末端肽的大规模定性定量分析。可信地鉴定到3601条原始N末端肽，这是目前为止Jurkat细胞最大的原始N末端蛋白组数据集。从定量到的差异N末端肽中鉴定到451个caspase作用位点，对应397个底物蛋白，其中199个为新发现的底物。.利用SILAC标记实现对原始成熟蛋白N末端和水解产生的新的N末端的同时标记，利用HYTANE策略富集N末端肽段，借助无动态排除的采集模式发展了一种基于二级谱碎片离子的末端肽段高准确度定量方法，分析了人肝癌高低转移细胞系的末端蛋白质组和全蛋白质组，解析了肝癌转移过程中末端蛋白质组的变化，为深入理解转移的机制开拓了新角度。