HGF转染的骨髓间充质干细胞干预闭塞性细支气管炎的实验研究

Mesenchymal stem cell (MSC) can inhibit lymphocyte proliferation through direct cell-cell contact and cytokine secretion. It's also multipotential cells and have exhibited some repairment abilities. Hepatocyte growth factor (HGF) has mitogenic, motogenic and morphogenic effects on various tissues, particularly the intestine, kidneys and lungs. HGF has been applied in the tissue repair process. The etiological factors of bronchiolitis obliterans include acute GVHD after bone marrow transplantation, lymphocytic bronchitis and bronchiolitis. Because of no effective treatment, bronchiolitis obliterans can finally lead to respiratory failure. We hypothesized that treatment with MSCs over-expressing HGF might be a novel strategy that can both repair the damage of the mucosa and supress the immonological reaction, which could ultimately stop the process of bronchiolitis obliterans. By using a mouse bronchiolitis obliterans model, we evaluated the preventive and therapeutic potential of MSCs over-expressing HGF.

间充质干细胞（MSC）可通过细胞间作用及分泌细胞因子抑制淋巴细胞增殖，能够减低造血干细胞移植后移植物抗宿主病的发生，同时MSC还具有多向分化潜能，可向损伤组织迁移并具有修复作用；肝细胞生长因子（HGF）在小鼠异基因造血干细胞移植模型中具有免疫抑制及修复损伤作用，从多环节减轻移植物抗宿主病的发生；同时本课题组在与军事医学科学院放射与辐射医学研究所的长期合作中发现HGF修饰的MSC可以抑制排异反应，延长移植物的生存时间；闭塞性细支气管炎发病最显著的危险因素为骨髓移植后的急性排异反应和淋巴细胞性支气管炎、细支气管炎，由于目前各种治疗疗效均不确切，最终可导致患者呼吸衰竭以致死亡；该课题旨在明确MSC和HGF两者联合是否具有免疫调节及组织修复的协同作用，以及其对造血干细胞移植后闭塞性细支气管炎是否具有防治作用，期望为HGF基因修饰MSC防治造血干细胞移植后闭塞性细支气管炎提供实验基础。

本实验采用HGF基因修饰的UCMSC治疗闭塞性细支气管炎，观察移植气管病理学变化，计算移植气管的阻塞率，评估HGF基因修饰的UCMSC对防治闭塞性细支气管炎的疗效，通过检测移植气管组织及血清中炎性因子的表达、脾脏中淋巴细胞表型的变化来研究基因修饰细胞的作用机制。.首先，按Hertz等人建立的方法建立了小鼠异位气管移植模型。为评价MSC在BOS小鼠体内的定植分布情况，我们分离、培养及鉴定EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞后，建立异种气管异位移植的BOS小鼠模型。待小鼠苏醒后，通过尾静脉输注经150MOI Ad-Null或Ad-HGF感染的mBMSC，在注射后不同的时间点，眼球取血，对移植气管、重要脏器进行取材并提取基因组DNA，通过实时定量PCR的方法检测EGFP基因在BOS小鼠体内的表达情况。将经150MOI Ad-Null或Ad-HGF感染的UCMSC细胞作为治疗用细胞，经尾静脉输注于BOS模型鼠，对照组输注200μL生理盐水，通过设立不同时间点及组别，收集移植气管固定后进行石蜡包埋、切片、H&E染色，观察移植气管纤维结缔组织的增生及炎性细胞浸润等病理形态变化，从而评价UCMSC对小鼠BOS的治疗作用及HGF基因修饰对疗效的影响。此外，应用酶联免疫吸附试验和Q-PCR的方法，检测了血液及移植局部炎症因子及抗炎因子的表达，通过流式细胞术检测脾脏淋巴细胞表型改变。.研究结果表明， BMSC移植后可以归巢并定植于移植气管损伤局部、血液、肝脏、肺等组织器官，HGF基因修饰可以促进BMSC的定植并延长其定植时间。MSCs-HGF及MSCs-Null治疗可以明显减轻移植气管内纤维结缔组织的增生、上皮细胞的坏死、脱落、缺失、炎细胞的浸润、气管环的破坏等BOS典型的病理变化，HGF基因修饰组作用优于MSCs-Null组。MSCs-HGF治疗后γ-干扰素表达降低，白介素-4和白介素-10的表达升高，同时促纤维化因子TGF-b1的表达水平降低。此外，细胞治疗后降低了由气管移植所诱导的脾脏淋巴细胞Treg，Th1/Th2，Th17的升高趋势，细胞免疫表型改变明显改善。.上述研究表明，HGF修饰的脐带间充质干细胞可以防止气管移植相关的气道纤维增生性病变，可通过调节炎症及纤维化的进程而发挥作用。本实验为HGF基因修饰UCMSC的临床转化提供了新的实验数据，为BOS提供了新的治疗策略。