中国Ⅱ型家族性假性醛固酮减少症PHAⅡA致病基因定位克隆的研究

Ⅱ型家族性假性醛固酮减少症（PHAⅡ），亦称为家族性高血钾高血压综合征，是具有遗传异质性的常染色体显性遗传性肾小管疾病。在已发现的3个PHAⅡ致病基因位点中，已有2个致病基因被克隆。本研究以中国的一个五代PHAⅡ大家系为研究对象，全基因扫描将该家系的致病基因定位在1q31.2-q32.2( PHAⅡA),利用NimbleGen序列捕获技术结合新一代高通量solexa测序技术筛选与鉴定PHAⅡA致病基因。采用定点突变、体外转录技术，利用爪蟾卵母细胞体外功能表达研究PHAⅡA致病基因的分子致病机制；进一步采用转基因小鼠模型揭示PHAⅡA发病机制。本研究对PHAⅡA致病基因克隆、基因诊断以及对理解常见高血压的发病机制有重要意义。

Ⅱ型家族性假性醛固酮减少症（PHAⅡ），亦称为家族性高血钾高血压综合征，是具有遗传异质性的常染色体显性遗传性肾小管疾病。在本项目申报时，已有2个致病基因被克隆（WNK4和WNK1）。本研究以一个五代PHAⅡ大家系为研究对象，采用连锁分析和高通量基因测序技术定位与鉴定PHAⅡ致病基因（PHAⅡA），并最终定位于Cullin 3基因，发现该基因9号外显子c.DNA第1235位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶（c.1235T>C）（杂合突变）。对另一个散发病例的测序分析发现一位于9号外显子上游5’端一核苷酸的突变c1207-20 A>G（杂合突变）。经在线软件预测分析和迷你基因pSPL3体外表达研究证明，这2个突变均为剪切突变（9号外显子剪除）。该研究证实，Cullin 3导致的PHAⅡ呈显性遗传，但也可能从头产生。在蛋白水平上，2个突变导致Cullin 3蛋白57个氨基酸（403—459）缺失。由cullin 3参与组成的Cullin-RING泛素链接酶（Cullin-RING ubiquitin ligases, CRLs）是泛素或蛋白酶体系统的重要部分。Cullin 3是环指蛋白（RING finger protein, Rbx1）、泛素缀合酶E2和底物衔接蛋白（如KLHL3）的支架。在爪蟾卵细胞表达系统的研究证实，突变型Cullin3通过抑制WNK的作用促进了Na-Cl共同转运蛋白的活性，证实突变基因和表型之间的联系。在哺乳动物细胞表达系统，证实突变型Cullin 3同底物衔接蛋白KLHL3存在正常的结合活性，但突变型Cullin3促进了衔接蛋白KLHL3的降解，间接减少了WNK的降解，从而增强了Na-Cl共同转运蛋白的活性，导致PHAⅡ。该研究在国内首次进行了PHAⅡA的致病基因定位和功能研究，对揭示机体对血压和电解质的调节具有重要意义，但遗憾的是美国耶鲁大学率先定位克隆了该病的致病基因，并发表与Nature。