线粒体重编程新分子FAM227A促进结直肠癌细胞重新获得干细胞特性作用机制研究

Colorectal cancer stem cells (CCSCs) contribute greatly to the invasion, metastasis and recurrence in colorectal cancer (CRC). Tumor microenvironment has been implicated in promoting CRC cells to reprogram into CCSCs. Thus, it becomes a premise for target-eradicating CCSCs to clarify how tumor microenvironment promotes the reprogramming of CRC cells. However, the molecular mechanisms remain poorly understood. We previously identified a new molecule FAM227A by mass spectrometry from mitochondria of CCSCs which were enriched by organoid culture. FAM227A, which was up-regulated by hypoxia and senescence, promoted CCSCs generation through mitochondria-translocation- mediated metabolic reprogramming and autophagy. Knockdown of FAM227A resulted in significant inhibition of CCSCs generation, indicating that FAM227A is an important molecule for tumor microenvironment to promote the reprogramming of CRC cells by modulating mitochondrial metabolism. But the molecular mechanisms of FAM227A remain unclear. Based on previous results, our current study is aimed to screen and identify the critical candidate targets of FAM227A, clarify the molecular mechanisms of FAM227A promoting CRC cells reprogramming, and investigate the interaction between tumor microenvironment and FAM227A based on PDTX and FAM227A knockout mice models.This study will lay a solid foundation for the development of new molecular targeted drugs to eradicate cancer stem cells in the future.

肿瘤干细胞是结直肠癌浸润转移和复发的主要原因之一。肿瘤微环境可促进普通肿瘤细胞重编程为肿瘤干细胞，阐明其重编程机制是靶向清除结直肠癌干细胞的基础，然目前对结直肠癌细胞重编程机制尚需明了。我们先前用质谱分析从类器官培养富集的结直肠癌干细胞线粒体中发现了一个新分子FAM227A，缺氧和衰老等促进FAM227A表达；FAM227A通过线粒体转位重编程能量代谢和诱导自噬而促进结直肠癌干细胞的生成，沉默FAM227A则抑制了结直肠癌干细胞生成，提示FAM227A是肿瘤微环境通过线粒体调控结直肠癌细胞重新获得干细胞特性的重要分子，然FAM227A分子作用机制尚不明了。本研究拟在先前基础上筛选和鉴定FAM227A关键作用靶蛋白并阐明其参与结直肠癌细胞重编程分子机制；基于PDTX和FAM227A敲除小鼠模型探讨微环境与FAM227A的相互作用。本研究为今后研发清除肿瘤干细胞分子靶向药物打下了扎实的基础。

为发现促进结直肠癌细胞重新获得干细胞特性机制，我们在本研究中发现肿瘤微环境响应性FAM227A在肿瘤组织中表达下调，而在结直肠癌干细胞中表达较高；HaloTag®TMR荧光配体标记检测示瞬时表达外源性的FAM227A定位以线粒体为主，而稳定表达的FAM227A定位于不含线粒体的胞浆中，仅少量分布在线粒体；Western blot检测示FAM227A可以独立于AKT的方式激活PI3K和增强p53的磷酸化，抑制PI3K活性则可减少FAM227A的线粒体转位，而且FAM227A还可增加SQSTM1和MTX1的表达，抑制PDH活性，促进线粒体自噬；促进P53突变型结直肠癌细胞重新获得干细胞特性，但抑制其小鼠致瘤能力。通过不同融合标签等策略，发现FAM227A易发生降解。免疫共沉淀结合Western blot检测示ANKRD22是一个与FAM227A互作的关键靶蛋白，介导了线粒体脂代谢重编程。除结直肠癌干细胞外，FAM227A关键作用靶蛋白ANKRD22也表达于巨噬细胞，在经IFN-gamma处理极化为M1样巨噬细胞中ANKRD22水平明显增高，荧光共定位检测表明ANKRD22定位于巨噬细胞线粒体。然而不同于结直肠癌干细胞的是，模拟肿瘤微环境刺激显著下调了巨噬细胞中ANKRD22的表达。基于基因敲除小鼠模型，发现ANKRD22沉默降低了巨噬细胞中线粒体Ca2+和胞浆NFAT的表达，延缓单核-巨噬细胞的时序分化进程。空间转录组测序结合Ankrd22-/-小鼠F4/80+细胞scRNA-Seq发现了一群新的具有较低脂肪酸b-氧化水平的CSF2RA+FOLR 2-LILRB4+ANKRD22-巨噬细胞，在共培养时能显著促进结直肠癌细胞重新获得干细胞特性的能力。鉴于ANKRD22与FAM227A互作的重要性，我们还利用同源建模和虚拟筛选还鉴定了4个ANKRD22抑制性和5个激动性小分子先导化合物。最后，我们通过制备5株人FAM227A特异性的鼠源性单抗建立了外周血FAM227A水解片段的定量检测方法，分析了不同肿瘤患者外周血中FAM227A的表达水平。本项目为今后进一步阐明结直肠癌细胞重新获得干细胞特性机制、发现潜在干预新靶点等研究建立了较好的实验支撑，发现的具有自主知识产权的先导化合物为重塑肿瘤抑制性免疫微环境药物研发打下了扎实的基础。