稀少糖修饰乳清蛋白的作用机理与功能性研究

以阿洛酮糖为代表的自然界中微量存在的一类单糖-稀少糖，由于其独特的生理活性，可替代蔗糖和葡萄糖成为一种新型甜味剂；同时稀少糖修饰的糖蛋白复合体也是功能食品与医药中间体的良好基料。我们的前期工作发现不同稀少糖修饰蛋白质，对蛋白质理化特性、生理活性产生明显影响，然而其糖基化的作用机制并不清楚。本申请拟选用己酮糖8个光学异构体作为糖供体（除D-果糖外其余均为稀少糖），利用美拉德反应对乳清蛋白进行糖基化修饰，通过肽谱、质谱、核磁共振、红外光谱，及生理活性功能评价手段，测定稀少糖修饰蛋白的程度和作用位点，分析中间产物的变化与反应进程，揭示糖基化对蛋白质大分子的结构、理化特性、生理活性与功能的影响，探讨己酮糖立体结构的差异与糖基化作用的关系，进而阐明稀少糖与蛋白质之间相互作用机理，为研究具有独特生理活性和良好加工功能的稀少糖-蛋白复合体、开拓稀少糖的应用领域提供理论依据。

以塔格糖、阿洛酮糖为代表在自然界微量存在的稀少糖，由于其独特的生理活性，可替代蔗糖成为一种新型甜味剂；稀少糖的糖基化修饰能改善蛋白质的功能特性，增加其新的生理活性。因此，开展稀少糖-蛋白复合体及其理化功能特性研究，揭示其结构与功能的关系，获得具有独特生理活性和良好加工性能的糖-蛋白复合体，能为稀少糖在功能食品和医药领域的应用奠定基础。本课题选用4种己酮糖作为糖供体（除D-果糖外其余均为稀少糖），利用美拉德反应对氨基酸、乳清蛋白等进行糖基化修饰，主要研究内容及结果如下：.（1）建立了Psi-Lys模式美拉德反应体系，对不同反应阶段的糖修饰程度及反应中间产物（含 N 的杂环化合物）进行分析，发现果糖和阿洛酮糖对初期阶段羰氨缩合反应无直接影响，但随着反应进行，3C及4C原子手性中心的构型及羟基的位置差异影响Amadori重排速率及途径，进而影响类黑素大分子产生，导致最终产物结构中不饱和杂环化合物的差异。.（2）在最适反应条件下获得了糖-乳清蛋白复合体，利用质谱测定了果糖和阿洛酮糖修饰乳清蛋白的程度，发现每个蛋白分子平均结合3-4个单糖。两种已酮糖在美拉德反应初期作用基本相同，后期则具有明显差异，进一步证明同分异构体果糖与阿洛酮糖的3-位羟基，影响糖-蛋白聚合度及棕色大分子化合物产生。.（3）利用示差扫描量热法测定修饰蛋白的变性温度，发现阿洛酮糖-乳清蛋白比果糖-乳清蛋白的热稳定性略有下降；圆二色性色谱分析显示这两种修饰乳清蛋白的二级结构没有变化，但阿洛酮糖-乳清蛋白三级结构较松散展开，导致其热稳定性有所降低，进一步验证了结构与功能较强的相关作用。.（4）对蛋白小肽及卵清蛋白的糖基化研究表明：与fructose 比较，tagatose、psicose、sorbose 三种稀少糖与蛋白反应褐变程度明显增强，其中tagatose反应程度最高；psicose能明显提高蛋白凝胶强度, 抗菌性与食品加工性能，同时延长了食品保藏期。.以上结果表明己酮糖3位及4位差向异构体的立体结构差异，导致糖-蛋白复合体在结构、理化特性和功能发生变化。本研究通过稀少糖修饰蛋白程度，中间产物变化与反应进程的分析及功能评价，揭示了己酮糖立体结构差异在糖基化上的作用机理，为开拓稀少糖的应用领域提供了理论依据。相关结果发表SCI论文3篇，会议论文1篇，专利1项，通过成果鉴定1项。