罗汉果甜苷糖基转移酶催化机制解析及修饰模块组装

The mogroside is a natural, low-calorie and high-intensity sweetener extracted from the fruit of Siraitia grosvenorii. It is the important bioactive components of triterpene glucoside. The Siraitia grosvenorii yield is restricted by special geographical and growth conditions, resulting in high price of mogrosides. It is urgent to develop new ways of production for meeting requirement of foodstuff industries. The degree of glycosylation determines mogroside sweetness. However, lt is not clear about glycosylation mechanism in mogroside biosynthesis. In the present, the glycosyltransferase (UGTs) sequences were screened and selected by high-throughput gene sequencing and gene mining techniques, and then cloning and expression. The candidate UGTs enzymes were obtained by further isolation and purification. Using the prepared mogrol and different mogrosides as substrates, the UGTs were analyzed and confirmed to be involved in the glycosylation of mogrol at C3/C24 hydroxyl to form mogroside. We should design and construct the recombinant expression system of sucrose synthase gene (Suc-syn) and candidate UGTs gene, supplying UDP-glucose as the sugar donor and screening aglycones substrate spectrum. Based on the characterization of the UGTs functions and analysis of the changes of product structure, it could reveal the glycosylation process and catalytic mechanism of mogroside sweetness. The modified modules of mogroside were assembled into Saccharomyces cerevisiae using DNA editing techniques. The srudy could be expected to lay the foundation for the biosynthesis of mogrosides and improve the sweetness of mogrosides.

罗汉果甜苷是重要的三萜烯葡萄糖苷天然高倍甜味剂，具有抗肿瘤、预防糖尿病等生理活性，但受种植环境影响，其产量低、价格高，无法满足食品工业需求。前期，本团队解析了罗汉果苷代谢途径并挖掘多个新酶，在酵母中合成了苷元前体。然而，甜苷糖基化作用机理研究较少，本研究针对罗汉果苷元C3-/C24-OH修饰的糖基转移酶（UGTs）挖掘、异源表达与功能表征，筛选修饰甜苷UGTs候选基因；在酵母中利用蔗糖合成酶基因（Suc-syn）和UGTs基因共表达体系，快速扫描配糖体底物谱，分析糖基化修饰作用；开展UGTs酶-底物对接及分子动力学研究，解析酶催化中心与底物的相互作用与底物立体选择性，揭示甜苷的顺序级联反应机制；解析UGTs酶修饰配糖体不同连接方式的同功酶，并利用DNA 编辑技术分别组装到酿酒酵母中，构建Primary-/Secondary-UGTs修饰甜苷功能模块，为罗汉果甜苷生物合成奠定基础。

罗汉果甜苷是重要的三萜类化合物，具有低热量、高甜度及抗肿瘤等生理活性，在食品与保健品领域具有重要应用价值。在罗汉果苷合成途径中，糖基转移酶（UGTs）所催化的糖基化反应是影响此类物质生理活性及甜味的重要因素，但罗汉果来源的UGTs存在催化活性低与区域选择性差的问题，且糖基化作用机理研究较少，限制了糖基化反应修饰应用。. 本研究首先利用基因测序及生物信息学技术，从罗汉果基因组预测了164条糖基转移酶基因，成功筛选到7条对罗汉果苷具有糖基化功能的糖基转移酶基因。其中，UGT74AC1和UGT74AC2能对罗汉果醇以及黄酮类化合物具有较好糖基化修饰功能。解析了上述两UGTs的晶体结构并同时构建了UGTs高通量筛选方法，先后利用随机突变、丙氨酸扫描以及序列一致性分析的手段，对获得UGTs进行分子改造，提高酶催化活性以及选择性，经多轮组合突变最终获得组合突变体M7，对罗汉果醇的催化活性是野生型的4.17×104倍，且完成了罗汉果苷的顺序糖基化反应，大幅提高野生型UGTs催化效率。. 为解析UGTs催化反应机制，结合酶蛋白晶体结构和计算机辅助模拟对本研究获得UGTs及其突变体的催化构象和自由能进行分析，结果发现突变体对罗汉果醇催化活性提升有赖于突变体酶分子与底物之间的疏水相互作用的增强，进而使得底物能够以更为合适的催化构象存在于活性中心，导致对底物催化活性显著提高。最后，利用上述优势突变体，以罗汉果醇为底物，开展了Primary/secondary-糖基化修饰研究，获得多种糖基化修饰的罗汉果苷产物，同时研究结果发现获得的UGTs能够进一步对代表性三萜类和黄酮类底物进行糖基化修饰，扩展了罗汉果来源的糖基转移酶应用领域，为天然糖苷类化合物合成提供了高效的催化元件及方法。. 综上所述，本研究通过挖掘并改造罗汉果来源的UGTs，提高了UGTs催化活性与区域选择性，并成功揭示了罗汉果苷的糖基化催化级联反应机制；同时，UGTs突变体底物谱的扩展为高效且专一的生物合成具有活性功能的天然产物研究奠定了基础。