运用比较蛋白组学方法观察糖络宁对糖尿病大鼠线粒体氧化应激相关蛋白的影响

本研究是在以往临床及实验研究的基础上，采用STZ诱导的糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠模型，针对DPN核心的发病机制氧化应激，运用最新的比较蛋白质组学研究方法，观察糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节线粒体电子呼吸链（ERC）复合物、线粒体顺乌头酸酶、抗氧化剂锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶、线粒体各类解耦联蛋白等多种功能性蛋白的影响，同时观察糖络宁对ERC呼吸功能、超氧阴离子产生，线粒体内膜膜电位、以及线粒体DNA的影响，从细胞分子水平阐明其作用机制，为中药治疗DPN提供科学依据，寻找中药治疗DPN的作用靶点或途径，为中药防治DPN的新药开发奠定基础。

本研究选择雄性SD大鼠80只，随机选择14只为正常对照组，其余大鼠予STZ造模，最终造模成功61只，将造模成功大鼠随机分为西药组、中药组、模型组，分别予以糖络宁制剂、α硫辛酸、等量蒸馏水灌胃，实验期间自由饮食，连续给药8周。给药结束后取两侧背根神经节组织（DRG），并提取线粒体做以下检测。1、使用极谱描记术Clark电极法对糖尿病大鼠DRG线粒体呼吸功能检测。结果提示，糖尿病大鼠DRG线粒体呼吸功能下降明显，硫辛酸可部分改善线粒体呼吸功能，糖络宁不能改善线粒体呼吸功能。2、使用光泽精化学发光法对线粒体超氧阴离子进行检测。结果提示，糖尿病大鼠DRG线粒体超氧阴离子产生比正常大鼠明显增加，而西药硫辛酸与中药糖络宁均可明显抑制线粒体超氧阴离子的产生，其中硫辛酸抑制更加明显。3、运用iTRAQ蛋白质定量技术进行蛋白质组学测定。通过蛋白组学研究显示，糖尿病大鼠的线粒体各复合物及顺乌头酸酶水平存在明显升高，而抗氧化剂的水平明显下降；西药与中药均可部分改善复合物水平过度升高的情况，而中药更可明显改善线粒体中抗氧化剂的水平。4、运用荧光分光光度仪比色杯法检测线粒体膜电位。结果提示，糖尿病大鼠DRG线粒体膜电位水平较正常大鼠明显下降；与糖尿病大鼠相比较，使用中药糖络宁与西药硫辛酸治疗的大鼠均可显著提高线粒体膜电位水平。5、线粒体DNA测定采用相对定量方法测定。结果提示：在高血糖状态下线粒体的DNA表达更加活跃，从而间接增加氧化应激的产生；而糖络宁和硫辛酸均可明显抑制神经细胞线粒体DNA的这种过度表达，间接抑制氧化应激的产生。6、应用双抗体夹心法测定大鼠DRG线粒体8 羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平，结果提示，糖尿病大鼠DRG线粒体中8-OHdG水平显著升高，线粒体DNA的氧化损伤十分明显，提示高血糖下线粒体中的氧化应激明显增加；糖络宁和硫辛酸均可明显减少神经细胞线粒体中8-OHdG水平，这表明糖络宁及硫辛酸均可减少高血糖导致的线粒体DNA的氧化损伤，对线粒体DNA起到很好的保护作用。7、运用透视电子显微镜对大鼠DRG线粒体进行观察。结果显示：与正常大鼠比较，糖尿病大鼠DRG线粒体肿胀明显，内部结构破坏严重，线粒体内特异结构嵴消失；而中药组大鼠DRG线粒体结构相对完整，线粒体嵴保存完好；西药组大鼠DRG线粒体也存在轻度肿胀，内部结构不完整，嵴显示不清楚。