运用RNAi基因沉默技术观察糖络宁对高血糖下大鼠背根神经元细胞中miRNA200a及其介导靶基因的影响

This study is based on the before clinical and libratory research. It uses rat DRG neurons under the high glucose condition to create diabetic peripheral neuropathy model. The study aims at miR-200a and its target genes——this newest basic core mechanism of DPN and use the RNAi gene silencing technology to observe the effect of Tangluoning to miR-200a and its target genes, lengths of the axons and the number and length of neurites of rat DRG neurons. It also observes the effect of Tangluoning to lengths of the axons and the number and length of neurites and the level of target genes, oxidative stress and apoptosis of DRG neurons transfected with siRNA-miR-200a or its target genes. The study wants to explore the mechanism of Tangluoning from bottom gene level and provide scientific evidence of TCM treating DPN. We are looking forward the target or way of TCM treating DPN and lay the foundation for the new treating-DPN drug exploitation.

本研究是在以往临床及实验研究的基础上，采用高血糖培养下大鼠背根神经元细胞的DPN模型，针对DPN最底层核心发病机制miR-200a及其介导靶基因，观察糖络宁对背根神经元细胞中miR-200a及其介导的Casp8等12个靶基因表达水平的影响，运用RNAi基因沉默技术观察其对siRNA-miR-200a转染后背根神经元细胞中Casp8等12个靶基因表达水平、树突长度、树突数量、轴突长度、细胞凋亡及氧化应激水平的影响，对转染siRNA-Casp8等9个靶基因后背根神经元细胞树突长度、树突数量、轴突长度及细胞凋亡水平的影响，同时观察其对转染siRNA-Gclc等3个靶基因后背根神经元细胞树突长度、树突数量、轴突长度及氧化应激水平的影响，从底层基因水平阐明其作用机制，为中药治疗DPN提供科学依据，为中药防治DPN的新药开发奠定基础，力求找到中药治疗DPN的作用靶点或途径。

背景及主要研究内容：本研究是在既往大量体内研究基础上，采用高糖培养下的大鼠背根神经元细胞的DPN模型，针对miR-200a及其介导的靶基因，探讨糖络宁防治DPN的作用机理。观察糖络宁对背根神经元细胞中miR-200a及其介导的Casp8等12个靶基因表达水平的影响，运用RNAi基因沉默技术观察其对siRNA-miR-200a转染后背根神经元细胞中Casp8等12个靶基因表达水平、细胞突起、细胞凋亡及氧化应激水平的影响，对转染siRNA-Casp8等9个靶基因后背根神经元细胞突起及细胞凋亡水平的影响，对转染siRNA-Gclc等3个靶基因后背根神经元细胞突起及氧化应激水平的影响。.重要结果及关键数据：①miR-200a转染前后miR-200a和靶基因表达水平：与正常组相比，模型组miR-200a、Casp8、Faslg、Jun、Mapk8、Map3k8、Tgfbr1、Tgfa、Stat5a、Aifm1、Acs14、Cdkn1b mRNA值明显增高（P<0.01），模型组Gclc mRNA值明显降低（P<0.01）；与模型组相比，中药组和抑制剂组miR-200a、Casp8、Faslg、Jun、Mapk8、Map3k8、Tgfbr1、Tgfa、Stat5a、Aifm1、Acs14、Cdkn1b mRNA值明显降低（P<0.01），Gclc mRNA值明显增高（P<0.01）。②转染miR-200a及靶基因后细胞凋亡水平：与正常组相比，各模型组凋亡水平明显增高（P<0.01）；与模型组相比，中药组和miR-200a、Casp8、Faslg、Aifm1、Jun、Mapk8、Map3k8、Tgfa各抑制剂组细胞凋亡水平明显降低(P<0.01)。③转染miR-200a及靶基因后神经元氧化应激水平：与正常组相比，各模型组ROS水平明显增高（P<0.01）；与模型组相比，中药组和miR-200a、Acsl4、Cdkn1抑制剂组ROS水平明显降低(P<0.01)，Gclc抑制剂组ROS水平明显升高(P<0.01)。.科学意义：经本研究发现糖络宁通过下调miR-200a改变其介导的12个靶基因表达水平，减轻高糖诱导的神经元细胞凋亡和氧化应激，改善高糖环境神经元细胞突起的抑制，治疗DPN。从底层基因水平阐明糖络宁作用机制，为中药治疗DPN提供科学依据，为中药防治DPN的新药开发奠定基础。