基于雪旺细胞线粒体动力学探讨糖络宁干预糖尿病周围神经病变的作用机制

Diabetic peripheral neuropathy (DPN), one of common complications of diabetes, belongs to a neurodegenerative disease. Currently, hyperglycemia induced Schwann cells (SCs) lesions are considered to be one of the main pathogenesis of DPN, but the molecular mechanism has not been clarified. The new studies suggest that imbalance of mitochondria dynamic is involved in the lesions SCs and diabetes. There is little research to declare neither how SCs mitochondria dynamic involves in the pathogenesis of DPN nor how traditional Chinese medicine act on SCs mitochondria dynamic to interfere DPN. On the basis of clear clinical efficacy and the mechanism related to oxidative stress, using DPN rats model and high glucose induced SCs model, and regarding SCs mitochondrial dynamics as the entry point, laser scanning confocal, flow cytometry, high content analysis, qRT-PCR and WB are used to investigate the relationship between mitochondria dynamic, mitochondria function and SCs lesions from in vivo and in vitro. The molecular mechanism of both mitochondria dynamic imbalance in DPN and actions and targets of Tang-Luo-Ning on mitochondrial dynamics will be investigated. It will provide new ideas for illustrating the pathogenesis of DPN, and provide the scientific basis of Tang-Luo-Ning on treating DPN.

糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病并发症之一，属于神经退行性病变。目前高血糖诱导的雪旺细胞（SCs）病变被认为是其主要发病机制之一，但分子机制尚未完全阐明。最新研究表明，线粒体动力学失衡参与了SCs病变及糖尿病的发病过程。但对SCs线粒体动力学参与DPN和中药作用于SCs线粒体动力学干预DPN的研究鲜有报道。在前期临床疗效明确和氧化应激的发病机制研究基础上，本项目利用DPN大鼠模型和高糖环境培养的SCs模型，以SCs线粒体动力学为研究重点，采用活细胞激光扫描共聚焦、流式细胞术、高内涵分析、qRT-PCR、WB等方法，从整理和离体实验两个方面进行线粒体动力学-线粒体功能-SCs病变相关性分析，探讨DPN中SCs线粒体动力学失衡的分子机制及糖络宁的干预机制和靶点，为研究DPN的发病机制提供新思路，为深入阐明糖络宁治疗DPN的分子机制提供科学依据。

本课题结合中医络病理论及现代医学对DPN的认识，在前期临床和实验研究基础上，利用DPN大鼠模型和高糖环境培养的SCs模型，以SCs线粒体动力学为研究重点，采用活细胞激光扫描共聚焦、高内涵分析、WB等方法，分别检测坐骨神经SCs和离体SCs中线粒体动力学蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1的表达、DRP1及其磷酸化的表达与线粒体定位等；检测线粒体功能相关指标如ATP、Ca2+、MMP、mtDNA等；检测SCs标记蛋白如MBP、MPZ和Sox10等的表达，从整理和离体实验两个方面进行线粒体动力学-线粒体功能-SCs病变相关性分析，探讨DPN中SCs线粒体动力学失衡的分子机制及糖络宁的干预机制和靶点。研究发现，糖络宁能够促进坐骨神经线粒体融合抑制线粒体分裂，从而增加ATP含量，减轻坐骨神经脱髓鞘，降低鼠尾热痛阈值，增加坐骨神经传导速度。糖络宁含药血清（TLNS）对高糖环境下SCs的线粒体结构、功能和线粒体动力学蛋白体现了其维持平衡的作用。具体表现为高糖环境分别干预24h、48h后，对于线粒体数量和覆盖面积、线粒体网状结构和平均分支长度，TLNS起到先降低后增加的作用；对于线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1的表达，TLNS起到降低后增加的作用，对于线粒体分裂蛋白Drp1和磷酸化（Ser616）Drp1以及线粒体的定位表达，TLNS起到增加后降低的作用，起到先抑制线粒体融合促进线粒体分裂，随后促进线粒体融合抑制分裂，从而维持线粒体动力学平衡的作用。同时，对于线粒体功能相关的ATP生成、MMP和mtDNA，TLNS起到先降低后增加的调节作用，以维持线粒体功能。最终发挥增加MBP、MPZ和Sox10表达，改善SCs病变的作用。以上研究结果验证了糖络宁通过调节高糖环境下 SCs 线粒体动力学失衡，改善线粒体功能障碍，降低 SCs 病变，进而干预 DPN的研究假说。为研究DPN的发病机制提供新思路，为深入阐明糖络宁治疗DPN的分子机制提供科学依据。