P53-miRNA23a在中波紫外线辐射后DNA损伤反应中的调控作用及其机制研究

中波紫外线是造成光源性皮肤损伤的重要环境因素。已证实P53和miRNA可在多种生命活动中发挥调控作用。参与P53调控网络的miRNA分子机制已在其他领域中形成研究热点，但在紫外线皮肤损伤研究领域尚属空白。我们在前期研究中发现miR-23a可参与调节紫外线辐射后DNA损伤及修复反应，并推测通过调控编码细胞周期相关蛋白的CCND1基因等多个P53靶点发挥抗光损伤作用。本课题拟进一步使用基因芯片及荧光素酶报告系统证实包括CCND1在内的多个基因是miR-23a发挥抗光损伤的真实靶位点，并采用低表达、过表达miR-23a研究方法及启动子研究路径，验证miR-23a是否通过调控CCND1基因参与P53网络，增强细胞对DNA光产物的移除能力，进而对紫外线损伤及修复反应发挥调控作用。上述研究不仅对揭示光源性皮肤损伤中"P53-miRNA调控网络"具有重要意义，而且可能为临床防治皮肤光损伤提供有效新靶点。

背景：细胞中的miRNA在生理条件下维持在一种较为恒定的水平。然而，在紫外线辐射后，miRNA的表达如何发生变化，及其在紫外线辐射后如何参与各项细胞生物学改变，目前尚不清楚。目的：本课题研究了miR-23a在中波紫外线（UVB)辐射后对人角质形成细胞系（ HaCaT细胞）DNA损伤及凋亡进程中的调节作用及其机制。方法：采用Agilent公司的人类miRNA芯片检测30mJ/cm2及60mJ/cm2UVB照射4及24h后HaCaT细胞中miRNA的表达变化情况，采用qRT-PCR的方法对miRNA进行验证，进一步确认基因芯片结果；并采用聚类分析方法对筛选出的miRNA进行分析。在HaCaT细胞中，对UVB照射后miR- 23a的表达变化进行定量RT -PCR检测。miR -23a的表达水平通过miR -23a模拟物或抑制剂转染进行调节。使用CCK- 8法检测细胞活力。使用免疫荧光染色和斑点杂交法检测细胞中环丁烷嘧啶二聚体的表达水平。使用Caspase-3活性流式细胞术、Hoechst染色等方法来测量细胞凋亡。通过实时定量RT -PCR和Western印迹法分别检测和分析与DNA修复与细胞凋亡相关基因，如拓扑异构酶- 1、caspase -7 和STK4的mRNA和蛋白表达水平。结果： 在HaCaT细胞中，UVB照射后4小时和24小时，mRNA-23a的表达显著上调。下调miR- 23a的表达显著增强UVB诱导的细胞凋亡水平。上调miR-23a的表达可以显著增强UVB辐射相关环丁烷嘧啶二聚体的清除，而miR -23a的下调则延迟这一过程。强制过表达miR- 23a减低UVB诱导的拓扑异构酶- 1 \ caspase7 \ STK4的mRNA和蛋白表达水平，并且这些作用可通过下调miR- 23a表达而被扭转。结论：本课题的研究证实在HaCaT细胞中，miR-23a可减轻UVB诱导的细胞生长抑制、细胞凋亡，并加速光产物环丁烷嘧啶二聚体的清除。MiR-23a通过调控与凋亡相关的Caspase-7及STK4、与DNA损伤修复有关的TOP1的表达发挥抗紫外线光损伤作用。MiR-23a可能成为治疗皮肤光源性损伤及光源性皮肤病的新靶点。