针刺调节水液缺乏性干眼的胆碱能通路及信号转导的研究

The dry eye is a common ocular surface disease. The early clinical study points that the acupuncture is effective. The rabbit model of dry eye is used in this research, and intervened by acupuncturing some effective points which are widely used in the clinical treatments. In the project, we measure the model rabbits' tear flow. We detect the content change of Ach in the lacrimal tissue. Immunohistochemistry and PCR technical are used to detect the expression of the lacrimal M3AchR and key protein and gene PLC?,PKC,IP3,P44/P42 MAPK in signal transduction. Immunofluorescence double-labeling is established to measure choline acetyltransferase and the c-Fos protein expression of reflex arc in the rabbits' brain which is related to the tear secretion. We observe the pathway of the Rabbits' tear secrete reflex central to lacrimal cholinergic regulation after acupuncture by nerve pathway retrograde tracking technology, explore the acupuncture information uploading to reflex central of tear secreted ,and then excited the cholinergic nerve to cause the M cholinergic receptor ,signal transduction and the facility of regulating tear secretion. We hope the experiment could verify the molecular biology signal transduction and mechanism of acupuncture on promoting dry eye rabbits' tear secretion from the view of the nerve reflex. This study is innovative, and through the systematic research, we can revolutionize scientific achievements about the mechanism of the dry eye by acupuncture.

干眼是临床上常见的眼表疾病，前期临床针刺治疗有效。本项目根据临床治疗中有效穴位对干眼实验动物模型兔进行针刺治疗，通过观察模型兔的泪液流量；检测泪腺组织中乙酰胆碱（Ach）的含量变化；免疫组化、PCR等方法检测泪腺中M3AChR及其介导的信号转导途径中关键蛋白及基因PLCβ、PKC、IP3、p44/p42 MAPK等的表达；免疫荧光组织化学双重标记技术等检测泪液分泌反射中枢脑区内乙酰胆碱转移酶及c-Fos蛋白的表达；通过神经通路逆行追踪技术观察针刺对模型兔脑区泪液分泌反射中枢至泪腺的胆碱能调节通路，探索针刺信息上传至泪液分泌反射中枢，再兴奋胆碱能神经，引起M胆碱受体及其介导的信号转导机理及调控泪液分泌的作用。从神经调节角度阐明针刺促进干眼模型兔泪腺分泌的分子生物学信号转导通路及作用机制，本研究具有创新性，通过该项研究对针刺治疗干眼的机制产生突破性进展。

干眼为临床上常见的眼表疾病，本病发病率高。前期临床研究显示针刺治疗本病疗效显著，但其作用机制尚未明确。为明确针刺治疗干眼的潜在作用机制，我们运用电子显微镜、Elisa/Real-time PCR/IHC/IF等现代实验技术进行了深入研究。通过研究我们发现，东莨菪碱皮下注射法造模具有一定的优势，兔眼表受刺激流泪可诱导兔脑部c-fos蛋白的表达，且刺激程度及部位均可影响c-fos的表达强度及部位，针刺可增加兔脑桥的被盖背侧核和臂旁外侧核的ChAT表达，促进兔泪腺分泌泪液。通过PRV逆行追踪技术发现，中枢神经系统与新西兰兔泪腺分泌泪液可能存在以下通路联系：下丘脑室旁核→脑桥上橄榄核群→脑桥上泌涎核→泪腺。这一通路可能是针刺治疗干眼泪液分泌的胆碱能调节通路的中枢解剖途径。通过对泪腺中的相关指标检测，针刺能够影响泪腺中M3AchR、IP3、PLCβ、PLD1、PKC、Ras、PyK2、Raf、MEK、MAPK等相关因子及凋亡因子的表达（P＜0.05）。电镜、光镜观察各组的泪腺微观形态学的改变，针刺组中泪腺柱状上皮细胞大小均匀，胞浆丰富，排列紧密，萎缩极少，最接近于正常组。以上结果共同表明，针刺治疗水液缺乏性干眼的作用机制可能为针刺信息调控泪液分泌的相关中枢，影响中枢胆碱能神经元的活动，兴奋相应胆碱能神经通路，进而刺激干眼实验动物模型兔泪腺M型胆碱受体及其介导的信号转导通路，抑制泪腺细胞凋亡，促进泪腺细胞主动分泌泪液，从而达到调控泪液分泌治疗干眼的作用。这些研究结果初步揭示了针刺治疗干眼的潜在作用机制，为今后的研究提供了新的方向，有利于发挥针刺在治疗干眼疾病研究中的特色和优势，为针刺治疗干眼的国际推广奠定了一定的研究基础，具有重要的学术和临床意义。