miR-29b沉默胶原基因抑制青光眼滤过性手术后滤过道瘢痕形成的实验研究

青光眼滤过性手术（GFS）后滤过道瘢痕化是导致手术失败的主要原因。其中TGF-β诱导Tenon's囊成纤维细胞（HTFs）向肌成纤维细胞转化，其持续存在并合成胶原等细胞外基质是滤过道瘢痕化的中心环节。miRNA是一类长度约19～24个核苷酸的微小RNA,在心、肝、肺、肾等器官纤维化疾病的治疗中显示出巨大潜力，已经成为开发抗纤维增生药物的新靶点。我们前期芯片结果显示，TGF-β刺激HTFs前后的miRNA表达谱中，miR-29b等多个miRNA存在显著性差异。已经证实，miR-29b靶向负性调控6种胶原基因表达。本项目综合运用荧光素酶报告基因、构建慢病毒载体，结合实时定量PCR、蛋白质印迹技术，体内、体外实验全面研究miR-29b在GFS术后滤过道瘢痕化中的作用机制。期望为进一步阐明GFS术后滤过道瘢痕化的发病机制提供新的思路，为保持术后滤过道通畅、提高GFS手术成功率提供新的手段。

研究背景：青光眼是常见的不可逆性致盲眼病，滤过性手术(GFS)术中联合应用抗代谢药物，如丝裂霉素C等能提高手术成功率，但可能产生严重的副作用。已有研究表明，miRNA与眼部组织纤维增生性疾病密切相关。.主要研究内容：通过高通量miRNA芯片筛选经TGFβ1诱导前后HTFs miRNA表达谱。运用生物信息学方法预测出miR-29b的靶基因。然后，通过构建miR-29b的慢病毒载体，结合运用实时定量PCR、Western Blot蛋白质印迹技术、双荧光素酶报告基因系统及MTT法、流式Annexin V/PI双染色法和平板克隆形成实验，系统研究miR-29b对PI3K/Akt/Sp1信号通路的调控作用及其对细胞增殖能力的影响。最后，建立家兔慢性高眼压模型，慢病毒转染组在术后滤过泡旁结膜下注射空载病毒对照液和慢病毒原液。通过观察术后眼压、滤过泡形态和功能的变化，同时检测miR-29b体内转染后靶基因mRNA表达变化以及转染后PI3K/Akt/Sp1信号通路的蛋白表达情况。.重要结果：高通量miRNA芯片结果显示，miRNA表达谱中，miR-29b存在显著性差异。miR-29b靶向调控COL1A1、PI3Kp85α、Sp1基因，通过抑制PI3K/Akt/Sp1信号通路的磷酸化水平来调控HTFs的胶原沉积。miR29b过表达能够在HTFs细胞模型和GFS动物模型中抑制胶原基因的表达，且能够促进HTFs的细胞凋亡，并抑制其生长和增殖。miR29b慢病毒体内转染可以更久地控制术后眼压和抑制滤过道瘢痕化。.关键数据：miR-29b在TGFβ1诱导后的HTFs中较正常HTFs表达量明显降低。经miR-29b慢病毒转染后，HTFs中促纤维化基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均成倍下降。通过双荧光素酶报告基因系统验证，miR-29b与上述靶基因序列具有阳性的抑制作用。家兔慢性高眼压模型行小梁切除手术后能形成滤过泡和降低眼压，术中应用丝裂霉素C与术毕及术后球结膜下滤过泡旁注射miR29b慢病毒原液均能更久地维持滤过泡的功能，但慢病毒转染组滤过泡评分更高。miR29b慢病毒转染组有最低的相关靶基因mRNA表达和PI3K/Akt/Sp1信号通路蛋白表达以及最少的胶原沉积。.科学意义：结膜下注射转染的miR-29b慢病毒原液可能是青光眼手术抗瘢痕治疗新策略，或许能开辟抗青光眼手术的新纪元。