Not1蛋白调节粗糙脉孢霉生物钟的机制

In molecular levels,the eukaryotic circadian clocks are composed of positive elements and negative elements to form a negative feedback loop. A wealth of data in the past have elucidated degradation pathways of negative elements, but stability regulations of positive elements are not fully understood.The Not1 protein is found to be in a complex with both WC-1 and WC-2. This project will be providing insight into how the Not1 protein is implicated in the circadian negative feedback loop.Our results will make it clear that the Not1 regulate the Neurospora circadian clock by a transcriptional or posttranscriptional manner. It will be addressed if the Not1 functions in the same pathway for its phase determination with the light receptor protein VVD. In addition,we are also interested in if Ccr4, Caf1, Caf40 and Not5, which are in a big complex with the Not1, are also involved in the circadian clock. As the working mechanism is similar among different organisms, new data will be beneficial to the positive elements research in mammals,flies,plants,etc.

在分子水平上，真核生物钟的负反馈回路是由正性成份和负性成份组成。过去的研究多集中在对负性成份蛋白的降解途径，但对作为转录因子的正性成份蛋白的稳定性调节研究较少。本项目用粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）作为材料，研究和生物钟正性成份WC-1和WC-2紧密结合的新蛋白Not1参与生物钟调控的分子机制。 围绕负反馈回路，搞清Not1是通过转录还是转录后调节参与生物钟的正常运行。探讨Not1对生物钟相位(phase)的影响是否涉及光受体蛋白VVD。另外，对和Not1存在于同一复合物中的其它蛋白，例如Ccr4、Caf1、Caf40和Not5等，初步了解其功能是否也与生物钟有关。本研究将揭示Not1或Not-Ccr4复合物对生物钟调控的内在机制。由于真核生物钟的工作原理在不同物种间大致相似，研究结果会对哺乳动物，果蝇和植物等生物钟正性成份蛋白的研究起到促进作用。

在分子水平上，脉孢菌的生物钟是由WCC和FRQ组成的负反馈环路组成，其中WC-1和WC-2形成的复合体（WCC）激活frq基因的转录。Not1能够和WCC结合在一起，并且对维持WC-1和WC-2水平至关重要。not1转录水平呈现昼夜节律变化，和frq基因转录水平相位一致。not1基因敲降导致WC-1和WC-2蛋白和磷酸化水平降低，转录活性提高和生物钟相位延迟。蛋白纯化试验表明Not1存在于Ccr4-Not复合物中。ccr4是一个生物钟调控基因，受WCC直接调控。ccr4基因敲降导致生物钟相位延迟，节律周期变长。. 由于Not1对脉孢菌生物钟调控机理并不清楚，另外Not1在真核生物中保守相似，接着我们将利用哺乳动物细胞来研究其调控机理。在哺乳动物的负反馈环路中，正向组分蛋白复合体CLOCK-BMAL1激活负向组分蛋白per和cry的转录，PER和CRY蛋白形成复合体进入细胞核内抑制CLOCK-BMAL1的活性。在哺乳动物中，真菌Not1蛋白的同源蛋白命名为CNOT1。 我们发现CNOT1能够分别与CLOCK和BMAL1结合，导致它们的磷酸化水平提高和蛋白稳定性增加。 蛋白免疫沉淀试验表明，过量表达CLOCK和BMAL1能够结合细胞内源的PKA激酶，并且CNOT1初进PKA与CLOCK和BMAL1的结合。在小鼠肝脏中，我们也看到了CNOT1与CLOCK和BMAL1的结合，并且这种蛋白相互作用具有节律，在ZT8结合多，在ZT16结合少，从而导致在ZT8时间点，CLOCK和BMAL1显示更高的PKA磷酸化水平。利用CRISPR-Cas9技术，我们得到PKA-Cα基因敲除的突变体。PKA-Cα基因敲除的突变体的节律周期变长；与此相反，过量表达PKA的U2OS细胞的节律周期缩短。 除了CLOCK和BMAL1以外，PER和CRY也是哺乳动物生物钟的核心蛋白。 在HEK293T细胞中分别瞬时表达Flag-PER2和HA-CRY2蛋白，结果显示，PKA底物磷酸化抗体只能识别PER2, 而不能识别CRY2，说明PER2和CLOCK与BMAL1一样，是PKA的磷酸化靶蛋白，并且CNOT1也能促进PKA介导的PER2磷酸化，蛋白降解试验证实PKA磷酸化增加了PER2蛋白的稳定性。. 我们的研究结果表明CNOT1和PKA结合，共同调控真菌和小鼠生物钟的正常运行。