Exosome复合物调节粗糙链孢霉生物钟蛋白FRQ同源异构体的转录后机制研究

FRQ是调节粗糙链孢霉生物钟的一个核心蛋白，存在lFRQ(large FRQ)和sFRQ(small FRQ)两种同源异构体，这两种同源异构体的生成比例受温度调节，并对生物钟的周期起着精确调节的作用。lFRQ和sFRQ的生成机制尚不清楚，可能是通过可变剪接或翻译过程中核糖体选择性扫描而导致的翻译起始位置不同而产生，目前尚无定论。我们在初步研究中发现，在exosome复合物关键基因rrp44 knockdown菌株中，sFRQ的生成比例显著增高，提示exosome参与FRQ同源异构体生成的调节。本研究将在此基础上，通过对rrp44 knockdown菌株中调节pre-RNA剪接、snRNA及核糖体扫描相关的候选基因进行分析，以阐明FRQ蛋白同源异构体的调节机制。本研究将不仅对理解生物钟蛋白的调节方式具有重要价值，对于理解基因表达过程中可变剪接、核糖体扫描等前沿问题亦具重要意义。

FRQ是调节粗糙链孢霉生物钟的一个核心蛋白，存在l-FRQ(large FRQ)和s-FRQ(small FRQ)两种同源异构体，这两种同源异构体的生成比例受温度调节，并对生物钟的周期起着精确调节的作用。l-FRQ和s-FRQ的生成机制尚不清楚，可能是通过可变剪接或翻译过程中核糖体选择性扫描而导致的翻译起始位置不同而产生，目前尚无定论。我们在初步研究中发现，在exosome复合物关键基因rrp44 knockdown菌株中，sFRQ的生成比例显著增高，提示exosome参与FRQ同源异构体生成的调节。本研究将在此基础上，深入研究FRQ蛋白同源异构体的调节机制。我们通过RNA-seq发现在粗糙链孢霉里敲减rrp44导致很多基因表达的变化，其中包括一些与可变剪接相关的基因。进一步的研究揭示，RRP44调节可变剪接复合物Spliceosome的基因表达、组装和功能，并通过调控pre-mRNA降解及剪接等不同方式调节基因剪接本的比例。Exosome也通过可变剪接复合物调控生物钟核心基因frq的可变剪接及其对应的蛋白同源异构体l-FRQ和s-FRQ的合成比例，可以部分解释rrp44敲减菌株周期变长的表型。我们还通过多种生化与分子生物学手段比较了l-FRQ和s-FRQ在生物钟调节过程中的功能差异，发现l-FRQ与s-FRQ相比更易磷酸化、更不稳定，且可能具有疏松的结构。并在l-FRQ比s-FRQ多出来的N'端99个氨基酸区段建立了系列的缺失菌株，从中鉴定出与表型相关的最小区域。本研究揭示了exosome参与调节可变剪接的新机制，也揭示了exosome调节FRQ同源异构体生成的调控机制。