遗传生物钟与代谢生物钟偶联机制的研究

The circadian clock is composed of two types of oscillators maintaining synchrony between the light-dark environment and internal biochemical processes.They are genetic oscillators, which consist of a transcription -translation feedback loop, and metabolic oscillators, which are involved in redox cycles.It remains unclear how these oscillators couple together.Rex,which is a bacterial NADH-binding protein,could link metabolic state to gene expression.While Rex is expressed in mammalian cells,it could bind to its operator followed by a promoter driving the luciferase gene expression. The luminescence signals would report intracellular energy state via the transgenic metabolic sensor. With this method，we would observe if the NADH/NAD+ display a circadian oscillation in living cells, and understand if reduced or oxidized state promotes the CLOCK:BMAL1 complex binding to the E-Box of targeted genes.This research will discover how genetic and metabolic oscillators communicate reciprocally.

生物钟是由基于转录和翻译负反馈环路调控的遗传振荡器和基于氧化还原变化的代谢振荡器组成。两种振荡器共同作用使生物体内源生化过程与外界光暗环境同步化，但是不清楚二者是怎样相互偶联的。来自原核生物的Rex蛋白能够结合NADH或NAD+,从而改变其转录活性。利用这一特性，我们在哺乳动物细胞中表达Rex蛋白，人工构建让荧光素酶基因的转录表达受控于含有能够与Rex蛋白特异结合的操作子序列。输出的荧光化学信号间接反应了细胞体内的氧化还原代谢水平变化。是否细胞内源NADH/NAD+含量呈现24小时节律变化就会通过这种异源表达转录系统活体实时记录下来。由于CLOCK:BMAL1能够节律性的结合到其调控基因的E-Box区域，这样就会进一步了解生物体内是还原条件还是氧化条件能够促进生物钟基因的转录表达，从而揭示遗传振荡器和代谢振荡器的相互关系。

我们从不同菌株中克隆到三种Rex基因，发现两种Rex基因在哺乳动物细胞中能够感受NADH浓度的变化。利用荧光素酶做为报告基因发现NADH浓度变化呈现24小时节律性变化。输出的荧光化学信号间接反应了细胞体内的氧化还原代谢水平变化。所以本研究发现了一种来自细菌的Rex蛋白可以感受哺乳动物细胞内NADH的浓度变化。这样就会进一步了解生物体内是还原条件还是氧化条件能够促进生物钟基因的转录表达，从而揭示遗传振荡器和代谢振荡器的相互关系。 课题另外一部分研究内容涉及生物钟蛋白的翻译后修饰。 蛋白质的翻译后修饰包括磷酸化，泛素化，糖基化和乙酰化修饰等，生物钟蛋白的不同修饰其功能也不尽相同，都有相关研究报导。有研究报道甲基化转移酶EZH2在组蛋白的识别位点为RKS，中间的赖氨酸是EZH2的靶位点。我们发现CLOCK和BMAL1都含有EZH2的识别序列RKS，推测EZH2可能甲基化CLOCK（439K）和BMAL1（277K）。为此我们利用CRISPR/Cas9技术制作了CLOCK(K439A) 基因敲入小鼠。小鼠跑轮结果表明，野生型的周期大约23.75小时，突变体小鼠的周期变长大约24小时，杂合子小鼠周期介于其中。比较小鼠肝脏CLOCK和BMAL1蛋白水平，我们看到突变体明显高于对照野生型小鼠，这和细胞瞬时表达的蛋白结果一致。以上结果表明CLOCK甲基化可能调控生物钟的节律周期。