靶向阻断KIT受体二聚化对胃肠道间质瘤抑制作用的研究

国外最新研究进展及我们前期实验结果均表明胃肠道间质瘤(GIST)的治疗需同时关闭非配体和配体依赖的受体信号通路，而以Imatinib为代表的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂仅能关闭部分非配体依赖途径，导致其治疗效果有限。我们推测，阻断KIT受体形成有活性的二聚体可同时抑制这两条通路，有望成为GIST新的治疗方向。为此，本项目采用特异性阻断KIT受体二聚化的方法，结合表达抗原差减法及蛋白分离分析，制备筛选出能同时阻断KIT同源和异源二聚体形成的单克隆抗体；进而在体内外两方面观察该抗体对靶细胞尤其是耐药细胞的杀伤性，以及对KIT受体所激活的信号通路的阻断作用；通过KIT单克隆抗体对GIST原代细胞的抑制实验，进一步验证"阻断KIT受体二聚化"对GIST的靶向治疗效果。本项目不仅是前两个自然基金项目的延续和拓展，而且所提出的"抑制KIT受体功能"的新策略对GIST治疗具有理论指导意义。

目的：依据戴默赛特（Dimercept, Herstatin）阻断HER-dimer形成的思路，制备一组特异性结合KIT受体二聚化功能区的鼠源性单克隆抗体（KITMAb），并在细胞学水平初步筛选出具有靶向阻断KIT受体二聚化效果的KITMAb。方法：采用经典的抗体制备法制备能特异性结合KIT受体二聚化功能域的鼠源性单克隆抗体KITMAb，经western-blot和免疫组化方法初步筛选后，用MTT、流式细胞仪和western-blot等方法观察KITMAb对靶细胞生长和受体磷酸化的影响。同时，采用DNA测序、免疫组化及western-blot等方法检测GIST中C-kit基因突变和KIT-Dimer蛋白表达, 统计学分析其与肿瘤预后的关系。结果：通过比较Native-PAGE及SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹法（western blot）对GIST肿瘤组织蛋白的检测，建立了一种可用于检测GIST组织中KIT-dimer蛋白的方法。统计学分析提示，KIT-dimer的表达与肿瘤大小、危险度分级、细胞核分裂数以及Ki-67增殖指数等肿瘤增殖相关指标明显相关，并且与c-kit基因突变和SCF表达水平也无明显相关性。成功采用经典的抗体制备法制备一组共11株能特异性结合KIT受体二聚化功能域的鼠源性单克隆抗体KITMAb，经western blot和免疫组化方法筛选出的6株细胞定位较好的KITMAb。细胞实验提示6株KITMAb均有抑制突变型KIT基因稳转细胞增殖的作用，并进一步筛选出靶向阻断作用较为显著的2株KITMAb，且对GIST原代肿瘤细胞KIT磷酸化有抑制作用。结论：成功建立了一种可用于检测GIST组织中KIT-dimer蛋白的方法，并证实GIST中存在着不同的KIT二聚化活化途径，检测KIT-dimer的表达可以作为判断GIST预后的一项指标。配体依赖的KIT/SCF通路不仅是野生型GIST形成的必要机制，同时也与突变型GIST进展密切相关。在GIST的治疗中，需要同时关闭配体依赖的KIT/SCF和配体非依赖两条信号通路才能更好地抑制GIST细胞的增殖。本研究成功制备并初步筛选获得的两株KITMAb具有抑制肿瘤细胞生长的作用，有望弥补imatinib治疗GIST的不足，为GIST的分子靶向治疗提出了新方向。