微纳操控技术在胃肠道间质瘤靶向治疗中的应用研究

During the clinical targeted therapy of malignant tumor, the resistance difference of patients to the same drug has brought great difficulties to clinicians. This project was designed to investigatethe mechanism of drug resistance difference by micro/nano manipulation on unicellular level, We will observe the change of the malignant cell phenotype and Gleevec targeting and the receptor molecule recognition site analysis by the application analysis of conventional molecular biology techniques; Using the robotic nanomanipulation technology to simulate the liquid physical environment, the acquired gastrointestinal stromal tumor cells from patients were subjected to drug receptor density detection and ligand-receptor binding force assay on single cell surface. Afterwards, analyze the mechanism of drug resistance difference by the model processing of cell force spectrum image and the construction of multi parameter model. The implementation of this project would early to predict drug resistance in patients with single cell from the scale, the theory will greatly promote the development of gastrointestinal stromal tumor diagnosis, mechanism of drug resistance in patients with malignant tumor rich differences, will greatly promote the personalized treatment of gastrointestinal stromal tumors.

在恶性肿瘤的靶向治疗中，药物对不同患者产生的耐药性差异问题，严重干扰临床医生的用药方案制定。本项目拟利用微纳操控技术在单细胞水平探讨导致患者耐药性差异的机制：通过获取胃肠道间质瘤患者组织标本细胞，首先应用分子生物学技术分析细胞恶性表型的变化，及对格列卫靶向受体分子进行识别和作用位点解析；然后，采用纳米操作机器人技术，模拟液态生理环境，在活体单细胞表面进行药物受体分子分布密度的检测以及配体-受体结合力大小的测量；通过细胞力谱图像的模式化处理与多参数疗效模型的构建，解析导致患者耐药性差异的机制。此研究项目的顺利实施，可以从单细胞尺度对患者耐药性进行前期预测，理论上将极大推动胃肠道间质瘤诊疗的发展，丰富恶性肿瘤患者耐药性差异的机制研究，将极大推动胃肠道间质瘤的个性化治疗。

本项目以推动胃肠道间质瘤诊疗发展，丰富恶性肿瘤患者耐药性差异的机制研究为宗旨，主要研究内容在于从三个层次对GIST患者术后靶向治疗研究进行解析，暨首先建立患者的临床数据资料库、其次在细胞群落水平进行分子生物学研究、最后着眼于AFM的单细胞水平检测，从整体到局部、不同层次、不同角度进行分析。首先，本研究发现Ki-67增殖指数与胃肠间质瘤细胞形状、核分裂相、NIH分级及靶向治疗相关，可以作为评估GIST患者预后的重要参考指标之一；其次中高危GIST患者中，Ki-67可能有助于临床区别更高危患者，制定更合理的靶向治疗和随访方案。第二，通过利用siRNA技术建立S100A4基因沉默的人胃癌细胞株，探讨S100A4对胃癌细胞恶性表型的影响及其作用机制。结果提示S100A4基因沉默的细胞体外迁移、侵袭和增殖能力显著下降，细胞凋亡增加，MMP-2蛋白表达明显降低，而E-cadherin蛋白表达则显著上调。说明，S100A4能通过上调MMP-2或下调E-cadherin的表达，影响肿瘤细胞的侵袭能力。检测S100A4基因沉默后细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路中Akt、mTOR磷酸化水平变化，结果提示，p-Akt、p-mTOR的蛋白表达明显下降，进一步检测细胞中VEGF蛋白表达，结果提示：VEGF蛋白表达显著降低。综上所述，S100A4能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路改变VEGF表达，从而促进胃癌血管生成。同时，S100A4基因沉默后，会导致细胞内游离钙离子浓度降低，进而引起PKC-α和CaM的蛋白表达降低，从而影响核内c-jun、c-fos的基因表达，导致肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力显著下降并诱导细胞凋亡。第三、本研究应用基于AFM的纳米压痕技术评估伊马替尼及舒尼替尼治疗前后单细胞机械力强度的变化，发现药物处理后GIST细胞杨氏模量减少，联合作用效果更明显，有可能介导PI3K/AKT/mTOR信号转导通路的上游细胞膜表面分子EGFR发挥作用。基于AFM的纳米力学分析是一种测量抗癌药物在生理条件下对活细胞作用的有效方法。这种方法提供了一种潜在的策略，用于检测抗癌药物在体外癌症治疗中的应用，可以将原子力显微镜作为一种测试手段，针对细胞机械强度变化在药物研发早期评估抗癌药物效率，以期望寻找新的药物靶点。