PKC-内质网应激途径对胃肠道间质瘤的靶向调控作用及分子机制研究

Endoplasmic reticulum stress (ERS) has been implicated in cell apoptosis as well as tumorigenesis. Cytotoxic drugs-triggered ERS causes tumor cell apoptosis and thus could be a promising target for tumor therapy. Previous studies have reported that ERS is involved in protein kinase C (PKC) inhibitor-induced tumor cell death. Similarly, in our pilot study, ERS was implicated in PKC inhibitor-induced cell death in gastrointestinal stromal tumors (GIST). We propose the following specific aims: (1) To determine the role of ERS in PKC inhibitor-induced GIST cell death. The MTT assay, immunofluorescence staining, cell cycle and apoptosis detection, Transwell migration assay, and in vitro invasion assay as well as molecular biology techniques will be used for the laboratory assay. (2) To further determine whether the role of PKC-dependent ERS in GIST cell death is modulated by mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, a well-known cellular signaling pathway which transduce a large variety of external signals, leading to a wide range of cellular responses, including growth, differentiation, inflammation, and apoptosis. This study will contribute to the scientific basis for better defining PKC-dependent ERS as a promising target for GIST therapy.

内质网应激（ERS）与细胞凋亡及肿瘤的发生、发展密切相关，因此通过应用细胞毒性药物诱发ERS，能为肿瘤的凋亡诱导治疗和逆转肿瘤再生耐药提供新的思路。文献报道提示，蛋白激酶C（PKC）抑制剂诱导的肿瘤细胞死亡与ERS有关，且申请人前期研究中发现，PKC抑制剂诱导的人胃肠道间质瘤（GIST）细胞死亡与ERS信号分子有关。因此本项目拟采用MTT法、免疫荧光染色、细胞周期与凋亡检测、Transwell迁移实验及体外侵袭实验等方法结合分子生物学技术，探讨PKC-内质网应激途径对GIST细胞的靶向调控作用，阐明PKC抑制剂诱导的GIST细胞死亡中ERS的作用靶点，以及通过PKC的内质网应激与MAPK下游信号通路在胃肠道间质瘤细胞死亡中的交叉作用。这将有效揭示ERS途径在PKC抑制剂诱导GIST细胞死亡中的作用和机制；为GIST靶向治疗找出新靶点。

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是一组独立起源于胃肠道间质干细胞的肿瘤。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是细胞转化包括肿瘤细胞转化的重要信号分子，也是介导肿瘤细胞粘附、运动、侵袭及转移的关键因素。现已证实PKC在多种生物活性物质调节细胞生长和增殖反应的信号传导过程中起重要作用，其为靶点研究肿瘤细胞增殖和诱导凋亡愈来愈引起重视。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS) 反应性凋亡途径是一种最近提出的新的凋亡途径，对ERS作用机制的研究，可使我们进一步加深对肿瘤细胞的生物学自我调控的了解，根据其引发ERS的机制及细胞内的自我调控机制，可以对肿瘤采取一些新的干预、治疗措施，达到预防和治疗的目的。基于PKC活性在肿瘤细胞转化中的作用及ERS反应性细胞凋亡途径在多种肿瘤细胞生长增殖过程中的作用，本研究利用MTT 法、免疫荧光染色、RT-PCR、Western Blot、细胞周期与凋亡检测、细胞迁移实验等分子生物学和细胞生物学方法，在GIST-T1 人胃肠道间质瘤细胞系中观察了PKC 抑制剂诱导GIST 细胞死亡中ERS 反应主要过程的作用、相关凋亡途径的影响，试图阐明PKC 抑制剂诱导的GIST 细胞死亡中ERS 作用靶点。结果，（1）成功建立了小鼠胃肠间质细胞分离和培养方法，但是继续传代培养细胞生长数量少、形态改变等现象。（2）PKC抑制剂Staurosporinec诱导GIST-T1和HT29细胞死亡，且IRE1、XBP-1 mRNA、GADD153、Bcl-2等ERS反应性信号分子表达增加，表明ERS反应性信号途径参与PKC抑制剂诱导的GIST和HT29细胞凋亡。（3）PKC抑制剂Staurosporinec导致GIST-T1和HT29细胞收缩变小，胞浆塌陷、凋亡小体增多，内质网应激p38、Caspase-3和磷酸化c-jun也发生了上调，ERS抑制剂有效阻止上述蛋白的表达增多，提示ST诱导的GIST-T1细胞凋亡与内质网应激途径和MAPK途径之间存在交叉联系。（4）PKC抑制剂Staurosporinec抑制GIST-T1细胞增殖和迁移，剂量依赖性的抑制VEGF的表达，提示PKC 抑制剂抑制GIST 新生血管的发生和侵袭转移。总之，本项研究有效揭示ERS