mTOR 分子参与调控的血小板自噬在 ITP 发病中的作用及机制研究

Primary immune thrombocytopenia (ITP) is an autoimmune abnormality-conducted thrombocytopenic syndrome. Previous studies have demonstrated that platelet autophagy may participate in the pathogenesis and therapeutic efficacy of many autoimmune diseases. Besides，mTOR play an important role in regulating platelet autophagy. Our previous results have revealed that the level of platelets autophagy in ITP patients was significantly different from that of normal controls, and was related to the patient's clinical condition.Those above indicate the potential role of platelet autophagy in ITP. However, the mechanisms of mTOR regulated platelet autophagy in ITP remain unknown. In this project, we speculate that mTOR may regulate platelet autophagy in ITP, subsequently the level of platelet apoptosis and function, and then ameliorate the platelets destruction in ITP. To test this hypothesis,we intend to verify the effect and precise mechanism of the molecular function mTOR, the level of platelet autophagy, combining the analysis of clinical characteristics, in vitro cell-culture, drug therapeutics and the mechanism exploration research. Our investigation will provide a novel target for the management of ITP.

原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种自身免疫功能异常导致的血小板减少综合征，研究发现血小板自噬可能参与ITP的发病，且mTOR分子在调节血小板自噬中起到了重要作用。我们前期研究发现，在ITP患者体内血小板LC3-II水平较正常对照组下降，且分析ITP患者的血小板计数、出血评分等我们发现，血小板自噬水平与血小板计数及功能呈正相关，这预示着血小板的自噬可能在ITP的发病中起着重要作用，而mTOR分子调节血小板自噬及对ITP疗效的具体机制目前尚不清楚。因此我们提出“mTOR及其下游beclin-1等分子参与调控ITP患者血小板自噬，进而影响血小板凋亡及功能水平，从而改善ITP患者体内血小板的破坏”这一假说。本研究拟 通过临床指标检测和体外实验相结合，从药物治疗和机制探讨等不同层面，揭示mTOR调控的血小板自噬在ITP发病中的作用及机制。

近些年来自噬的功能已经成为国内外研究的热点，越来越多的证据显示自噬在一系列生理及病理活动中起着至关重要的作用，如维持细胞内稳态、抵御饥饿等不良环境、细胞发育、病原体清除及抑制肿瘤发生，尤其是它在自身免疫平衡中的调节作用收到了越来越多的关注。原发免疫性血小板减少症(Immune Thrombocytopenia, ITP)是临床最常见的获得性自身免疫性出血性疾病。最近有研究显示在ITP患者中自噬通路相关蛋白的表达明显上升，提示自噬可能在ITP发病中起着重要作用。西罗莫司能够引起淋巴细胞凋亡，增加调节性T细胞数量，因此，它可能对其他非ALPS的免疫性血细胞减少病人也有效，如ITP，目前有研究显示西罗莫司可用于复发难治型ITP患者的治疗。我们实验室前期研究结果显示，在ITP患者体内血小板LC3-II/LC3-I水平较正常对照组降低，这预示着血小板的自噬可能在ITP的发病中起着重要作用。因此我们提出假设：血小板的自噬在ITP发病中发挥重要作用，西罗莫司可以通过调控mTOR等分子途径影响血小板的自噬，从而抑制血小板凋亡，改善ITP患者体内血小板的破坏。分析正常人与 ITP 患者血小板自噬水平与 Beclin-1、LC3分子表达水平的相关性，分析血小板自噬水平的变化与血小板计数、血小板功能、临床出血评分(病情严重程度)之间的关系。结果显示对比ITP患者及正常人临床资料，ITP患者的血小板计数及血小板黏附聚集功能明显低于正常对照，出血评分明显高于正常组，这符合疾病的表现。利用western-blotting检测证实自噬相关蛋白mTOR、LC3、Beclin1、p62、ATG5、ATG7在两组血小板中均有表达，对比发现LC3、Beclin1在 ITP患者血小板水平低于健康对照者且血小板自噬水平与血小板功能呈正相关，与出血评分呈负相关。分析抑制mTOR 分子表达前后血小板自噬水平的变化;，结果显示rapamycin处理后，血小板内Beclin-1、LC3表达上升，且血小板聚集功能上调；此外ITP患者血小板凋亡水平明显高于健康对照者，rapamycin处理后可以降低ITP患者血小板凋亡水平而Beclin-1与Bcl-xl分子的结合较对照组增多，推测rapamycin可通过上调血小板Beclin-1水平，抑制Bcl-xl分子，从而抑制血小板凋亡、改善血小板功能从而起到ITP治疗作用。