CDC42调控长管骨中软骨发育的信号机制研究

We previously demonstrated that one of Rho small GTPase, Rac1, regulates canonical Wnt signaling and limb bud development through increasing the accumulation of beta-catenin in nuclei (Wu X. et al. Cell 2008;133:533-44), however, whether it is common effects of Rho small GTPase to regulate canonical Wnt signaling and limb bud development or not is still unknown. Base on our premier findings that another membrane of Rho small GTPase, CDC42, dose not regulate canonical Wnt signaling and canonical Wnt signaling-controlled limb bud development, but regulates endochondral ossification in conditional CDC42 knockout mice, we will further study the mechanism governing CDC42 regulates condensation, chondrocyte differentiation and hypertrophic differentiation in endochondral ossification, and study the potential upstream and downstream events of CDC42 signaling that regulates the cartilage development as well. This study will provide with the new theory for bone development that controlled by CDC42 and non-canonical Wnt signaling.

我们以前的研究（Wu X. et al. Cell 2008;133:533-544）表明Rho 小G蛋白Rac1通过调节beta-catenin的细胞核内堆积而实现对经典Wnt信号和肢芽发育的调控，Rac1调控经典Wnt信号和肢芽发育是Rho 小G蛋白普遍现象还是Rac1所特有的尚不清楚。我们探索性的研究表明在胚胎肢芽的顶外胚层嵴信号中心敲除Rho 小G蛋白另一成员 CDC42不调控经典Wnt信号和肢芽发育，而在胚胎肢芽的极化活性区的间充质干细胞敲除CDC42导致显著的软骨发育不良的表型，以此为依据，本项目进一步探索CDC42调控间充质干细胞成软骨细胞分化过程中的间充质干细胞condensation、间充质干细胞向软骨细胞分化以及软骨细胞进一步向肥大软骨细胞分化的信号机制，以及可能的上、下游信号事实。通过本研究，为Rho小G蛋白和Wnt信号调控骨骼发育提供新的理论和实践依据。

Rho家族的小G蛋白（Rho small GTPase）成员包括Rac1、Cdc42和RhoA作为 “分子开关”调节细胞周期、细胞运动、生长、粘附、基因转录活性、信号传导等重要功能。我们通过体外细胞学研究及条件性基因敲除小鼠研究了Cdc42在软骨内成骨过程中具有重要作用，并探讨其作用机制。首先，顶端外胚层嵴敲除Cdc42（Msx2Cre;Cdc42f/f）的转基因小鼠中， Cdc42并不参与调控顶外胚层嵴的发育。间充质细胞敲除Cdc42（PrxCre;Cdc42f/f）的小鼠呈现出四肢短粗、颅骨开放性缺失的表型，进一步H&E染色发现Cdc42敲除的转基因小鼠股骨中心有过度增生的肥大软骨细胞，不能出现正常的血管入侵。取PrxCre;Cdc42f/f胎鼠股骨进行成骨与软骨分化标记基因的原位杂交，结果提示Cdc42通过调控软骨分化过程而不是成骨细胞的分化而调控长管骨发育。Sox9是软骨发生早期阶段的主要决定因子， Sox9的whole mount原位杂交显示在E12.5野生型小鼠中Sox9表达于尺、桡骨及跖骨形状的细胞聚集区及其软骨结构的部位，而缺失Cdc42的转基因小鼠中Sox9的表达弥散于整个肢芽结构。小鼠胚胎成纤维细胞（C3H10T1/2）的微团培养结果显示敲降Cdc42可以抑制BMP-2所诱导的细胞聚集，而持续激活Cdc42可以增强BMP-2的诱导作用。以上实验结果均说明Cdc42在间充质细胞聚集过程中扮演了重要的角色。进一步探讨Cdc42调控间充质细胞聚集的机制，我们揭示了Cdc42调控间充质细胞聚集过程是通过BMP-2/Pak1/p38/Smad信号通路实现的。间充质细胞聚集后会向软骨细胞分化，然后发生肥大化。我们分别检测了软骨分化标记基因Col2a1的表达，软骨分化转录因子Sox9荧光素酶报告基因活性，肥大软骨细胞敲除Cdc42的转基因小鼠表型等，结果提示Cdc42同样参与软骨细胞分化过程，但不参与软骨细胞的肥大化及成熟过程。Cdc42调控间充质干细胞向软骨细胞分化的信号机制为TGF-β/Pak1/AKT/Sox9。综上所述，Cdc42通过BMP-2/Pak1/p38/Smad信号通路正向调控间充质细胞聚集，同时Cdc42通过TGF-β/Pak1/AKT/Sox9信号通路调控软骨细胞的分化，但不影响软骨细胞肥大化。