重组NanA靶向清除呼吸道上皮唾液酸分子抑制流感和副流感病毒感染的作用和机制研究

大量研究发现，密布于呼吸道上皮细胞表面的唾液酸（Sia）分子，是流感病毒和副流感病毒启动感染、释放新生病毒颗粒的关键受体。提示调节Sia可能作为抗流感病毒感染的靶点。申请者前期报道：重组神经氨酸酶NanA(rNanA)专一识别并高效水解Sia化合物。进一步预实验显示：以rNanA 处理犬肾(MDCK)细胞，可快速清除Sia分子、有效限制流感H3N2病毒株的感染。因此，我们提出靶向修饰宿主Sia，可望广谱抑制依赖Sia介导的病毒感染。本项目将以几种低毒力流感和副流感病毒株为例，通过研究rNanA的去Sia效应与细胞修复之间的平衡，以及rNanA是否干预病毒诱导的免疫病理损伤和主要细胞因子、趋化因子变化等，探明其抑制流感病毒感染的机制；同时研究rNanA鼻腔滴入对防治流感小鼠继发肺炎球菌感染的作用,监测其肺部病理变化和血清抗NanA 抗体滴度等。为实现新型Sia靶向清除抗流感策略提供作用机制。

密布于呼吸道上皮细胞表面的唾液酸分子，是流感病毒启动感染、释放新生病毒颗粒的关键受体。申请者提出靶向修饰宿主Sia，可望广谱抑制依赖Sia介导的流感病毒感染。在国家自然科学基金81170007的资助下，本项目首先克隆、重组了rNanA基因，其后表达并提纯了适宜的rNanA，经MALDI-TOF质谱指纹鉴定及酶活性检测后用于后续实验。随后进行了病毒蚀斑实验，以不同浓度rNanA 处理MDCK细胞或小鼠鼻腔给药，rNanA在0.05mg/ml范围时能有效限制低毒力流感A/Udorn/72病毒株 (H3N2)感染。这为逆向针对宿主受体，开发新型的抗流感病毒病毒制剂，奠定了重要的科学基础。在动物水平，rNanA鼻腔滴入初步试验发现：BALB/c小鼠对rNanA的耐受性较好，上述细胞水平终浓度范围内未见明显的毒性效应。我们的流感病毒小鼠感染模型研究显示：病毒感染前、同时或感染后1天给予rNanA鼻腔给药，均能显著降低H3N2流感病毒感染小鼠的致死率。进一步利用rNanA抑制流感病毒株A/Udorn/72小鼠感染的实验研究显示：病毒感染前、同时或感染后1天给予rNanA均能显著降低H3N2流感病毒小鼠的血液中病毒低度。ELISA法检测模型小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13，IL-37干预组肺泡灌洗液中的浓度明显下降且P<0.05。我们相信，鼻腔喷雾是一些呼吸系统药物常用的给药方式，经黏膜吸收后发挥作用，为局部直接给药，最大限度降低药物的毒副作用。而鼻腔给予新型靶向NanA，直接接触呼吸道上皮细胞即发挥药效，完全不受药物吸收率的影响。NanA可有效预防和控制甲流病毒感染，鼻腔喷雾能有效降低机体对生物药物的反应。上述研究结果充分验证了项目设计的合理性、科学性和应用前景，达到了预期实验目标，最终为实现基于宿主唾液酸分子靶向清除策略的新一代抗呼吸道流感和副流感病毒感染研究提供作用机制和研究基础。