基于钠离子通道受体的海洋神经毒素协同分析方法及膳食暴露探索研究

Marine neurotoxins are natural products with high toxicity and mortality, which could be accumulated and transformed through the food chain. As a main cause of food-poising, marine neurotoxins present a serious hazard on human health. This project will focus on six types of marine neurotoxins widespread in China. With the assistance of genetic engineering and molecular biology techniques, much effort will be devoted to obtain the voltage-gated sodium channel (VGSC) and its core binding domains that serve as the specific receptor of many neurotoxins. In combination with advanced analytical and bio-sensing technologies, the VGSC receptor will be consequently used as a key binding unit to establish a collaborative platform for marine neurotoxin analysis. This platform effectively integrates toxicity evaluation and chemical structure identification, including: receptor-affinity LC-MS/MS method for ultra-sensitive and multi-target quantification, receptor-affinity high resolution MS method for unknown toxin screening, receptor-based biosensors for on-site fast detection, and receptor-affinity preparative LC method for marine neurotoxin standards production. Furthermore, the platform will be employed to investigate the contamination and distribution of marine neurotoxins in typical seafood, and monitor their variations depending on the seasons, sea areas, and seafood species. As a consequence, a primary database could be founded and applied to conduct a preliminary dietary exposure risk assessment. This project will greatly facilitate forewarning of potential toxic seafood, prevent seafood-poising, and provide technical support for regulation and maximum limit setting. In addition, the experience and achievements might cast new light on other natural toxin studies.

海洋神经毒素毒性强烈、致死率高，并可通过食物链累积和迁移，是食物中毒的重要原因，严重威胁人类健康。本研究以我国广泛分布的六类海洋神经毒素为研究对象，采用基因工程与分子生物学技术，通过组织提取或蛋白表达，获得海洋神经毒素通用型结合受体--电压门控钠离子通道蛋白及其核心识别片断；进而整合多学科交叉优势，系统地构建兼备毒性评价作用与结构确证功能的海洋神经毒素协同分析平台，实现对已知毒素的超微量、多组分同步定量分析，对未知毒素的捕捉筛查和结构鉴定分析，便携式生物传感器现场快检分析，以及珍贵毒素标准品的环境友好型分离制备；在此基础上创建我国典型海产品中海洋神经毒素污染分布及变化规律基础数据库，初步探讨居民膳食暴露风险及主要贡献来源。为高风险海洋食品的预警，指导居民膳食选择，预防中毒事件的发生，及相关政策和限量标准的制定提供技术支持，为其他天然毒素的综合研究提供创新思路。

本项目以我国分布广、毒性强、致死率高的海洋神经毒素为研究对象，采用基因工程及分子生物学技术，通过体外蛋白表达优化，成功获得6His标记的海洋神经毒素通用型受体——电压门控钠离子通道蛋白Nav1.1的α-亚基，跨膜表达于HEK293细胞膜上，并获得稳转细胞系，目标序列正确，且经膜片钳测试，具备电生理功能，为后续研究提供了生物核心识别材料。在此基础上利用体外表达Nav1.1的HEK293细胞及跨膜电位敏感的荧光探针，建立海洋神经毒素靶向毒性测定荧光传感技术，能够快速、高通量实现海洋神经毒素毒性作用机制（激动剂、抑制剂）鉴定、获得其EC50及IC50值，以及对毒性当量进行半定量表征，可用于对未知化合物神经毒性的预警、高通量筛查及毒性强弱的评价。同时，针对典型海洋神经毒素，开发通用型前处理、聚合物离子填料分散固相微萃取、及自组装管尖固相萃取技术，建立了一系列针对单一毒素和多毒素同时检测的UPLC-MS/MS痕量精准检测技术，适用于海产品、海水及中毒生物样本中海洋毒素的痕量精准检测。进而，对我国渤黄海、南海海域采集的154份海鱼样本及渤黄海486份贝类样本中海洋毒素进行测定。南海117份海鱼样品中TTX，GTX-1，GTX-4，dcSTX，dcNEO，STX，NEO有检出，检出率14.5%，鳐鱼、长尾鲳鱼、豆腐鱼、马鲛鱼样品毒素含量较高（>200 μg/kg），而我国消费量较大的海鱼品种绝大部分未检出或含量很低；渤黄海37份海鱼样品中无海洋神经毒素检出；渤黄海贝类样品仅4份检出C1，C2，STX毒素，2份检出dcSTX，GTX-2毒素，且含量均较低。结合区域的海产品消费量及FAO/WHO/IOC制定的临时急性参考剂量（ARfDs），进行典型地区居民海洋毒素膳食摄入计算及极性暴露风险评估。结果显示，南海区域高暴露人群有一定的急性健康隐患，渤黄海区域城镇居民和渔民的海洋毒素暴露水平均不超过国际健康指导值，健康风险较低。本研究为未知毒素的筛查、预警、神经毒性鉴定、以及典型海洋毒素的定量检测提供了多种技术平台，为全国食品污染监测计划提供了参考方法，为进一步大范围的调查评估提供了可借鉴方法和经验，为相关政策和标准的制定提供了部分基础数据。本研究已申请专利1项，发表文章8 篇（SCI 6篇），另有1项专利和3篇SCI文章在整理中，将作为后续成果提交。