复杂天然产物中Diels-Alder酶催化反应研究

寻找和发现新型酶催化反应一直是有机化学领域极具挑战性的课题。现代生物技术和化学原理的进一步融合使得人们对于新型酶催化反应的需要由简单底物的生物转化逐步转向复杂化合物的合成，而酶的发现方式也由被动应用转向主动寻找，由蛋白水平深入到基因水平。鉴于Diels-Alder反应在有机合成中的重要性，我们采用一种全新的思路来发现复杂天然产物中催化Diels-Alder反应可能的Diels-Alderase。本课题充分借鉴现代生物技术发展的最新成果，以蕴涵可能Diels-Alderase催化反应的复杂天然产物环链菌素的生物合成研究为切入点，从基因的角度，采用遗传学与有机化学相结合的方法来发现环链菌素生物合成过程中可能的Diels-Alderase，进一步采用基因工程与有机化学相结合的方法探索其在有机合成中的应用。

本课题选择生物合成过程中可能蕴含Diels-Alder反应的复杂天然产物的生物合成研究为切入点，通过克隆生物合成基因簇获得基因材料，采用遗传学和生物化学相结合的方法阐明生物合成途径，致力于发现可能的Diels-Alderase。在化学生物学杂志（Chem. Biol.）发表论文2篇，另有1篇正在审稿中；申请专利1项；培养博士研究生2人。. 四重霉素（Quartromicin，简写为QTM）是一株东方拟无枝酸菌产生的抗病毒天然产物，结构十分奇特：C2对称性的大环结构完全以C－C键相连，分子中包含四个螺乙酰内酯类结构单元，4条连接螺乙酰内酯结构的聚酮链两两相同，相邻者之间相差一个2C单位的延伸。目前关于该分子的生物合成推测中普遍接受的观点是包含两次分子间的D-A反应形成分子核心骨架。根据已报道的含螺乙酰内酯单元的天然产物生物合成基因簇，通过遗传水平的比较，我们设计了一组针对高度保守的独特基因负责特征性的乙酰乙酸内酯单元形成的PCR克隆策略。运用该方法我们成功克隆了QTM的生物合成基因簇，根据序列分析的结果提出了QTM的生物合成途径，通过体外生化实验重建了乙酰乙酰内酯聚酮链中间体的生物合成途径；发现并阐明了一种特殊的PKS催化的聚酮链跳跃机制：一套PKS同时催化两条不同长度聚酮链的生成。.在初步提出其生物合成途径的基础上，我们通过化学合成的底物，体外的生化实验进一步研究了可能的D-A反应前体，含有双键的乙酰乙酸内酯的生物合成：阐明了一种酰基活化（QmnD3），进而脱乙酸形成双键（QmnD4）的机制。通过定点突变我们初步阐明了这两个酶催化反应的关键氨基酸残基，并提出了酶反应的酸碱化学机理；特别是关于QmnD4的研究揭示了α/水解酶家族中一种全新的催化反应。. 此外，我们还开展了复杂螺环天然产物越野他汀（Kosinostatin，KST）的生物合成研究，希望寻找其生物合成中独特的酶催化反应。首先克隆了完整的生物合成基因簇，证明了独立存在的、单功能NRPS的A功能域特异地识别烟酸，通过ATP活化后形成AMP复合物，转移到PCP功能域形成硫酯。经过系列修饰后形成特殊的氨基取代的氮杂五元环硫酯，进而与五碳糖发生系列特殊的修饰生成氮杂双五元并环硫酯中间体；然后与II型PKS催化形成的蒽环中间体反应形成螺环中间体。为下一步深入研究新的酶催化反应奠定基础。