新型增强型虾青素水稻的创制及其代谢合成机制研究

Astaxanthin is the highest class of natural keto-carotenoid with the highest antioxidant activity, which promotes cardiovascular health and anti-aging for human. However, astaxanthin cannot be synthesized by animal and higher plants. In a preliminary study, we have created, for the first time, the first generation of astaxanthin rice by multi-transgene stacking of four key structure genes, PSY、Crt I、BHY and BKT, in rice endosperm to synthesize astaxanthin. To further develop new generations of astaxanthin rice, we will explore the strategies of regulating the metabolic flux direction and increasing the plastid repositories to enhance astaxanthin biosynthesis. (1) Selection of the regulator OR gene that enhances carotene (the substrate of astaxanthin) biosynthesis and the upstream key enzyme gene DXS from different plant species that have higher activities. (2) Transformation of rice with all the six genes, to obtain the second generation of astaxanthin rice with enhanced astaxanthin biosynthesis; (3) On the basis of (2), using CRISPR/Cas9 to knock-out of the rice gene OsCCD1 that degrades carotenes, to further increase astaxanthin content in the endosperm; (4) Using transcriptomic, proteinomic, and metabonomic analyses to elucidate the metabolic mechanism of the carotene/astaxanthin biosynthesis in rice endosperm. This study will develop new type of biofortified rice, and has important theoretical significance and wide application prospect.

虾青素（Astaxanthin）是类胡萝卜素的最高级形式，具极强的抗氧化活性，对心血管健康、延缓衰老等具有重要作用，但动物和高等植物中不能合成。前期研究中，申请人用多基因代谢工程方法在水稻胚乳特异表达PSY、Crt I、BHY和BKT基因，创建了第一代虾青素水稻。为了研发更高含量的新型虾青素水稻，本研究从调控代谢流和增大质体存储库两方面，强化虾青素的合成。（1）从不同植物筛选出强活性的促进类胡萝卜素（虾青素的底物）合成的调控基因OR和上游途径基因DXS；（2）将上述6个基因转化水稻，获得增强虾青素合成的第二代虾青素水稻；（3）在（2）的基础上，以Cas9敲除分解类胡萝卜素的内源基因OsCCD1，获得更强化虾青素合成的第三代虾青素水稻；（4）以转录组，蛋白组，代谢组联合分析阐明虾青素水稻中类胡萝卜素/虾青素代谢合成机制。本项目以新技术创制新型营养功能型水稻，具有重要的理论意义和应用前景。

虾青素（Astaxanthin）是类胡萝卜素的最高级形式，具极强的抗氧化活性，对人体心血管健康、延缓衰老等具有重要保健作用，但动物和高等植物中均不能合成。为此，我们用具有自主知识产权的多基因叠加系统TGSII，在水稻胚乳特异表达PSY、Crt I、BHY和BKT四个基因，首次在水稻胚乳从头合成了虾青素，创建了第一代虾青素水稻“赤晶米”（Astaxanthin Rice，AR）。但是其含量不高，需要进一步增加虾青素的含量。为此，利用合成代谢工程策略，从调控增强上游代谢流和增大质体存储库两方面同时入手，进一步叠加上游关键酶基因DXS和类胡萝卜素调控基因OR，强化虾青素的合成。我们构建了水稻胚乳特异表达的DXS、OR、PSY、Crt I、BHY和BKT六个基因的多基因载体pYL380MF-DOBBPC。利用农杆菌介导的遗传转化方法，分别转化水稻籼稻华光1（HG1）和粳稻中花11（ZH11）品种，经分子检测、表达分析与含量成分分析，获得了转基因纯合、精米表型为深红色、种子胚乳虾青素含量更高的增强型虾青素水稻AR2新种质（籼稻背景的AR2-H和粳稻背景的AR2-Z）。与AR相比，增强型AR2-H株系中，类胡萝卜素总量和虾青素总量都增加了约2倍，分别达到45μg/g和30μg/g；而在AR2-Z株系中，类胡萝卜素总量增加1.5倍（22μg/g），虾青素总量增加2.8倍（12.5μg/g）。类胡萝卜素合成相关的内源基因与外源转基因的qRT-PCR分析、AR2的转录组与代谢组分析等都表明，外源基因的转入，特别是DXS和OR基因的叠加，增加了内源胡萝卜素合成相关基因的表达，促进了虾青素的含量的增加与积累。此外，水稻内源番茄红素环化酶基因Lcy-ε和Lcy-β在粳稻与籼稻背景中的表达差异，导致转基因籼稻能合成更多的虾青素。上述工作提供了一种多基因代谢工程与合成生物学的作物育种新方法，为解析水稻（作物）类胡萝卜素代谢调控与合成的研究奠定基础，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。