解脂耶氏酵母合成虾青素的系统代谢工程研究

Yarrowia lipolytica is a model oleaginous yeast which has been widely used in biotechnology researches as it is generally recognized as safe (GRAS) and it also has clear genetic background. The rich lipid content of Y. lipolytica is beneficial to the production of several hydrophobic natural products including various types of terpenoids which have been widely used in the development of new drugs and pesticides. In this project, the metabolic control characteristics underlying the heterogeneous biosynthesis of astaxanthin and the enhancement of astaxanthin production in Y. lipolytica will be intensively investigated. Detailed studies will be focused on the introduction of various biosynthetic pathways, analysis and engineering precursor pathways, 13C isotope-based quantitative metabolic analysis, genome-scale metabolic network model based simulations, as well as genetic and experimental verification, in order to direct the rational optimization of astaxanthin biosynthesis. The long-term goal of this study lies in the design of Y. lipolytica to be an excellent terpenoid-producing microbial cell factory and also the providing of rational metabolic analysis and strategies for the engineering of other oleaginous microorganisms.

解脂耶氏酵母是一种可安全用于食品和药物生产且遗传背景清晰的模式产油脂酵母菌，已经在较多方面得到了广泛的研究。这类微生物细胞内的丰富油脂也能为众多疏水性有用化合物（比如在新药、杀虫剂等方面广泛应用的萜类化合物等）的累积提供有利条件。本项目针对解脂耶氏酵母异源合成四萜化合物虾青素的效率优化提高，逐步递进地从合成模块整合、前体物合成途径的分析及改造、基于13C稳定同位素信息的代谢网络定量解析、以及基因组规模代谢网络模型预测仿真等基因工程及系统代谢工程角度，系统深入地理解该酵母菌合成以虾青素为代表的四萜化合物的代谢控制特点、以及有效增强菌株各代谢模块适配性并促进目标代谢物合成的优化改造策略。本项目的长期目标在于充分理解解脂耶氏酵母的代谢功能并将其开发成能够高效合成多种重要萜类化合物的细胞工厂，同时也为认识和改造其他产油脂微生物提供关键的代谢分析基础和改造思路。

项目组紧密围绕既定研究计划，在构建能异源合成多种类胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌株、该菌株CRISPR/Cas9基因编辑系统开发、解脂耶氏酵母代谢组学方法的建立及应用、基因组规模代谢反应网络模型构建及相关模拟预测方法的开发应用、以及解脂耶氏酵母异源合成β-胡萝卜素及虾青素等工程菌株的发酵培养优化等方面进行了多方位研究。项目组取得了如下主要研究成果：（1）构建了十余株具有应用潜力的能有效合成类胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌株，在常规发酵培养条件下可获得近1 g/L的番茄红素及4.5 g/L的β-胡萝卜素产量，在常规摇瓶条件下能合成近100 mg/L虾青素；（2）开发了解脂耶氏酵母的CRISPR/Cas9分子操作系统并筛选到20个可用于基因敲入的整合位点，同时成功构建了相应的sgRNA和donor质粒对；（3）综合评价了解脂耶氏酵母代谢组学研究中样品预处理、提取及检测方法，首次发现使用二甲基亚砜溶液作为淬灭溶剂能有效防止细胞内氨基酸代谢物的渗漏，从而拓宽了代谢物检测范围；（4）将微生物基因组规模代谢模型与代谢组学数据联系起来，建立了代谢途径丰度算法，有助于理解细胞整体代谢途径的变化特征；（5）构建并持续更新了解脂耶氏酵母基因组规模代谢反应网络模型，开发了能够快速识别敲除靶点的IdealKnock算法、菌株细胞生长-生产偶联分析（APGC）算法、以及在基因水平上预测代谢改造靶点的模型转换技术等，在微生物代谢模型应用领域获得了广泛的关注和使用。这些成果对于深入理解和提升包括酵母细胞在内的多种重要微生物的代谢性能、高效设计能有效合成目标化合物的工程菌株具有重要的借鉴意义。