利用诱导型转基因小鼠模型研究猪骨骼肌发育相关microRNA在不同生长阶段的生物学功能

microRNA是一类发育过程中极为重要的调控因子，其在猪骨骼肌不同时期发育过程中差异极为显著。近两年已经分离出一批猪肌肉特异性microRNA，但这类因子的生物学功能研究较少。本研究以已报道的猪骨骼肌内发现的多个小RNA为候选小RNA，利用过表达和干扰的方法，进一步筛选影响肌细胞生长分化的小RNA；并通过转基因技术，制备四环素诱导型过表达特定小RNA的转基因小鼠模型，研究其在不同发育阶段骨骼肌发育中的生理功能。然后克隆其中有用小RNA上游调控序列，制备表达EGFP的转基因小鼠，研究其时空表达特征；最后，结合mRNA表达和生物信息学，鉴定其相应的靶标，进而推测出影响骨骼肌发育的遗传因子和信号通路。本项目充分利用诱导型转基因小鼠模型来研究具有时空特异性的猪骨骼肌发育机制，可以更准确和全面地阐明猪骨骼肌生长发育的分子机制，本研究为解析产肉性状的形成机制和生产性状的改良奠定了基础。

本项目结合前期研究基础，对影响猪骨骼肌发育相关的microRNA进行了筛选，筛选出同时在猪及小鼠体内存在的microRNA378-1、miRNA-143等一批可能影响肌肉发育相关的目标microRNA。构建microRNA-378-1过表达载体，转染小鼠和猪细胞，进行分化检测；细胞水平验证具有显著生物学效应后制备转基因小鼠，一方面，对转基因小鼠进行分子生物学鉴定，在DNA、RNA水平上进行检测并培育纯合子转基因小鼠，另外一方面对转基因小鼠生长曲线、外在表型以及肌肉形态进行形态学鉴定。结果表明，转基因microRNA-378-1对肌肉发育有显著促进作用。细胞模型研究表明MicroRNA-378-1在肌肉分化过程中的生物学功能，并且发现GRB2（growth factor receptor-bound protein 2）是MicroRNA-378-1的靶标基因。对血液中生长发育相关激素检测结果表明，microRNA-378-1转基因小鼠血清内生长激素及IGF-1显著高于对照组。已有的检测结果表明，microRNA-378-1对肌肉发育具有明显的促进作用。构建可控表达microRNA-378-1载体并在猪胎儿成纤维细胞开展诱导表达检测，结果表明可控表达载体能有效控制外源microRNA-378-1的表达，为后续开展在猪体内验证其对猪肌肉发育调控奠定基础。本项目的开展揭示了microRNA在猪肌肉发育中具有重要作用，为利用和调控microRNA对肌肉发育的影响奠定基础。