利用可控表达转基因技术研究肌细胞内生长激素自分泌作用机制

Muscle developing was not only regulated with endocrine pathway, but also affected by the autocrine in muscle cell. It was proved that GH is a key factor affected muscle development. Deep studys into the GH to endocrine regulation mechanism of organism development were taken in recent years, and muscle dysplasia was found closely connected with GH abnormal autocrine. No system study on GH autocrine disorder to muscle development, growth axis and vicinity tissue paracrine has been reported. The hypophysis specific expression GH inducible expression transgenic mice was as control mice, GH inducible expression transgenic mice was prepared, GH and GH shRNA specifically expressed in muscle. Our study focus on the relationship between GH autocrine to muscle development and time node of the affection will be founded. Our findings may help to elucidate the molecular mechanism and signal pathway of GH autocrine, help to better use GH in livestock production. It will lay a theoretical foundation on GH applied in livestock transgenic safety and high efficiency. In addition, this will also helpful to detection and treatment the related muscle diseases from GH autocrine disorder in clinical medicine.

动物机体不仅通过内分泌途径调控肌肉发育，肌细胞还能通过自分泌机制促进或抑制自身的分化。生长激素（GH）通过自分泌调控方式对机体发育有非常重要的影响，在家畜生产及医学临床上研究发现肌细胞中 GH 自分泌失衡和肌肉发育异常紧密关联。肌细胞内GH自分泌对肌肉发育、对生长轴及对邻近组织旁分泌的影响都未见系统报道，本项目率先利用可控表达转基因技术对肌细胞GH内自分泌作用进行系统研究。本项目组在已经制备的垂体特异性过表达GH小鼠模型、诱导表达GH转基因小鼠模型的基础上，制备肌肉中可调控表达GH的转基因小鼠模型，通过在不同发育阶段对转基因小鼠肌肉中外源GH的表达进行精细调控，研究GH自分泌对肌肉、邻近组织及机体GH 生长轴内分泌的影响及产生效应的时间节点。本研究有助于阐明肌细胞中 GH 自分泌影响的分子机制,在家畜生产中利用GH自分泌作用促进肌肉发育,也有助于研究并治疗GH 自分泌异常引发的相关疾病。

生长激素（growth hormone, GH）是由垂体分泌的一种促进动物机体生长、肌肉发育、调节代谢等重要生理功能的多肽激素。本项目在细胞、转基因小鼠及猪中开展利用可控表达系统研究GH基因在猪肌细胞及肌肉组织中自分泌作用机制。本研究首先在传统四环素调控表达系统的基础上进行改进，构建了整合型GH基因及GH shRNA表达载体，在细胞水平利用QRT-PCR及western检测其调控效率，并检测强力霉素（Deoxycycline, DOX）诱导后外源GH基因的表达效率；利用显微注射法制备的整合型可控表达GH转基因小鼠，并繁育出一批F1代转基因小鼠，分组开展GH诱导表达实验，研究结果表明，出生后转基因小鼠中外源GH基因表达可以加快生长速度，增加肌肉量的同时，对转基因小鼠自身健康无不良影响。进一步将该整合型诱导表达载体转染猪胎儿成纤维细胞，利用徒手克隆法制备出转基因克隆猪并通过人工授精繁育出F1代转基因仔猪，转基因猪与非转基因猪进行分组，断乳后通过饲料中添加DOX开展诱导试验。和对照组非转基因猪相比，转基因猪后代窝产仔数、转基因仔猪初生重及断奶重无显著差异，DOX诱导后转基因猪生长速度明显提高，眼肌面积及骨骼肌肌肉量也有显著增加。未经DOX诱导的转基因猪和正常猪间速度则无明显差异；GH基因表达提高后，肌肉组织中线粒体活性相关蛋白表达量增加，线粒体数目增加。本研究进一步构建了pGH过表达载体，并设计了2条用于pGH基因沉默的siRNA，转染细胞后观察对细胞及线粒体相关功能的影响。和正常细胞组相比，GH siRNA转染细胞组和GH过表达细胞组中GH表达水平分别有显著的下降和增加。利用细胞流式术对细胞周期进行检测发现，GH过表达及表达下降后对细胞周期及凋亡均有显著影响。GH表达变化在对线粒体数量、形态学及功能均有重要影响，细胞活性氧ROS及膜电位均有明显增加。本项目初步推断猪pGH基因在肌肉组织中能不依赖内分泌调控系统，通过自分泌途径影响肌细胞中线粒体功能进而调控肌肉代谢。