人参多肽结构与镇痛作用机制的研究

In previous studies, we found that polypeptide components fron Panax gingseng showed significantly analgesic effect, and the analgesic effect was independent of opioid receptor. The results that L-Arg (a substrate for nitric oxide synthase) enhanced the analgesic effect and L-NAME (an NO synthesis inhibitor) reduced the analgesic effect implied that the analgesic effect of ginseng polypeptides was involved in the synthesis of NO. Contents of this project: the ginseng polypeptide components will be purified further, and the primary structure will be confirmed. Classic peripheral and central nervous system analgesic animal models will be selected, to define the site of analgesic effect. Through studying the expression, location and distribution of various substances in rat brain glial cells and dorsal root ganglion cells, and transmission of nociceptive information of NO by NO-cGMP-PKG signal transduction pathway, to comprehensively evaluate the analgesic mechanism of ginseng polypeptides. The results of this research will establish a solid foundation for the development of new drugs with independent intellectual property rights.

前期研究工作首次发现，人参中的多肽组分具有显著的镇痛作用，其镇痛作用与阿片受体无关，而一氧化氮合成底物L-Arg和一氧化氮合成的抑制剂L-NAME对镇痛作用的增强与降低结果提示，其人参多肽镇痛作用可能与NO的合成有关。本项目研究内容：拟对人参多肽组分进一步纯化，确定各多肽的一级结构；选用经典的外周及中枢神经镇痛模型，明确镇痛作用部位；通过对大鼠脑胶质细胞和背根神经节细胞中各物质的表达、定位及分布的影响以及NO通过NO-cGMP-PKG信号通路参与脊髓水平的伤害性信息传递途径的研究，对人参多肽镇痛作用机制进行综合评价。本项目研究结果将为开发具有自主知识产权的新药奠定坚实地基础。

目的：通过纯化人参水提物，得到人参糖肽组分并解析其结构，利用体内和体外实验阐明其镇痛作用机制。方法：利用超滤、透析、Sephadex G-15凝胶色谱、HPLC分离纯化人参水提物。建立角叉菜胶诱发大鼠炎症痛和福尔马林诱发大鼠疼痛模型，腹腔注射给予人参糖肽，利用Elisa法检测大鼠血清中炎症因子表达水平、脑组织5-羟色胺、多巴胺与去甲肾上腺素表达水平。利用Western blot等方法检测人参糖肽调节脊髓水平的伤害性信息传递能力。考察人参糖肽对小鼠催促戒断反应的作用。结果：得到了22个糖肽的一级结构。与模型组比较，人参糖肽给药剂量为30mg/kg、60mg/kg时可显著降低IL-1、IL-2、IL-4、TNF-α与组胺表达水平，并对大鼠的足肿胀度有显著的抑制作用（P＜0.05）。在福尔马林诱发大鼠疼痛模型中，各剂量人参糖肽对单胺类神经递质均无明显影响。人参糖肽40 mg/kg能够显著增加海马（P<0.05）、前额叶皮层（P <0.05）的NO水平。人参糖肽 20、40 mg/kg能够显著降低海马CA1区可溶性鸟苷酸环化酶sGC表达；40 mg/kg能够显著降低海马组织PKG和PKC的蛋白表达。20、40 mg/kg均能够显著降低海马组织PI3K和磷酸化p38的蛋白表达水平；nNOS抑制剂Spermidine（0.5 mg/kg）单独给药能够显著降低海马、前额叶皮层、脑干和丘脑的NO水平。40 mg/kg能够显著降低海马、脑干和丘脑的cGMP水平，Spermidine（0.5 mg/kg）单独给药对cGMP水平没有显著影响。人参糖肽（40 mg/kg）和Spermidine（0.5 mg/kg）合用能够降低cGMP水平。sGC抑制剂NS-2028（7 mg/kg）单独给药能够显著降低海马、前额叶皮层、小脑和丘脑的NO水平。PGG(40 mg/kg)和NS-2028（7 mg/kg）合用能够降低上述5个脑区NO水平。人参糖肽40 mg/kg均能够显著降低海马组织PI3K、PKG表达和p-p38/p38比值。Spermidine对上述三个蛋白表达均没有显著性影响。成瘾性实验结果证实：人参糖肽对小鼠催促戒断反应呈阴性。结论：人参多肽具有明显的镇痛抗炎作用，作用部位可能属于外周性镇痛作用，镇痛作用机理可能与调节促炎细胞因子（IL-1、TNF--α）和抗炎细胞因子（IL-2、IL