一种新4/8型alpha镇痛芋螺多肽的作用靶点及结构功能研究

The neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is one of the most important ion channels and membrane proteins, which is related to the signal transduction of learning sensation memory and pain. Alpha-conopeptides can target different subtype of nAchRs and are very important in identifying the function of different nAchRs and developing the novel therapeutics. In our previous study, we identified a series of alpha-conopeptides of Conus species from South China Sea. Among these conopeptides,a novel subclass (alpha4/8) alpha-conopeptide Vt1.27 containing significantly different amino acid residues was identified.We then synthesized and purified this peptide and found that its analgesic activity (rat PNL and CCI model) is very potent ( nmol/kg level). In this study, we will determine its target and selectivity on different subtype of nAchRs, and probe functional amino acid residues by Ala scanning method. Furthermore, we will determine analgesic activity of Vt1.27 mutants modified by acidic,basic or hydrophobic amino acid residues. Through aforementioned study, we will obtain the targets and activity of Vt1.27 on nAchR subtypes and structure-function relationship. These studies are beneficial to obtain a good analgesic drug lead or develop the novel probe for neuropharmacological study.

神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）是最重要的离子通道及膜蛋白之一，与学习、感觉、疼痛等多种信号传导密切相关。Alpha-芋螺多肽能作用于不同亚型的nAChRs，对发现nAChRs亚型的功能及治疗药物具有重要意义。前期我们从中国南海芋螺中发现了一系列新的Alpha-芋螺多肽，其中一种具有新颖氨基酸序列的Alpha-芋螺多肽Vt1.27属于一种目前未见报道的亚型，合成纯化了该肽并发现其具有很高的镇痛活性（大鼠PNL和CCI模型）。本课题将采用双电极电压钳方法测定其对nAChRs亚型的确切靶点及选择性,采用Ala取代的方法揭示其关键的氨基酸残基，进一步采用碱性、酸性或疏水氨基酸等替代获得突变体，并测定突变体对nAChRs亚型的活性及镇痛活性。通过以上研究，以阐明Vt1.27对nAChRs的活性及选择性，揭示其结构与功能的关系，并为进一步镇痛药物开发和研制新型神经药理探针奠定基础。

本项目主要研究一种新4/8型alpha镇痛芋螺多肽Vt1.27的作用靶点及结构与功能关系的研究，目前已经顺利完成任务书规定的研究内容，取得了较好的结果。实际完成的研究内容有以下几个方面：（1）合成、折叠、纯化了Vt1.27的多肽，得到了16mg纯品，测定了Vt1.27的NMR结构（2）利用双电极电压钳检测了Vt.27对不同神经型烟碱乙酰胆碱受体亚型的活性和选择性，发现了Vt1.27对神经型烟碱乙酰胆碱受体α3β2具有较好的活性，而对其他乙酰胆碱受体没有显著作用。（3）利用膜片钳这一关键技术，我们研究了Vt1.27对GABA介导的高电压的钙离子通道的活性以及对低电压钙离子通道（L型），钠离子通道（Na1.4，Na1.5）的活性，发现Vt1.27除对Cav2.2通道具有一定抑制活性外，对上述其它通道均没有明显作用,我们在大鼠DRG细胞中也证实了其对大鼠DRG细胞的钠离子和钾离子通道没有任何作用。(4) 采用Ala取代的方法，设计并合成纯化了7个Vt1.27的突变体，测定了Vt1.27系列突变体对乙酰胆碱受体α3β2的活性，发现其9位的氨基酸对其活性较为重要。（5）我们根据计算机模拟分析和Ala取代的实验结果，设计合成了3个突变体，采用大鼠神经性疼痛模型，测定了这3个突变体的镇痛活性，发现其中一个突变体Vt1.27-P-COOH的镇痛活性显著提高。通过以上研究我们阐明了Vt1.27镇痛多肽的结构活性关系，得到了一个镇痛活性显著提高的突变体，为进一步镇痛药物开发和研制新型神经药理探针奠定了基础。