怀山药化感物质的分离分析研究

Allelopathy research has important theoretical guiding significance and practical significance in the field of ecosystem and agroforestry system. Firstly CO2 supercritical fluid extraction and microwave assisted extraction and other extraction methods were used to systematically extract the tubers, bubils, stems and leaves of Chinese yam. Then, the extractions were divided into different polarity segments. Bioassay method in lab was used to select the polarity segments that have the allelopathic activity. The allelopathic active parts were separated to prepare the pure allelopathic compounds by prepared chromatography and high-speed countercurrent chromatography and the other separation technologies. The structures of the allelochemicals isolated can be identified using modern spectral analysis. The qualitative and quantitative analysis methods of these allelochemicals were established by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis technology to monitor the soil after planting Chinese yam and the dynamic changes of the content of allelochemicals in the plant growing process. In order to investigate the allelopathic effects of the active compounds, to verify its mechanism, and to lay the foundation for the next cropping obstacles study of Chinese yam, the effect of different concentrations of allelochemicals on the bubil germination and plant growth were investigated using bioassay method combining with field trials.

化感作用研究在生态系统、农林系统等领域具有重要的理论指导意义和实践意义。本项目首先利用CO2 超临界流体萃取、微波辅助萃取等提取方法对怀山药块茎、茎叶、零余子进行系统的提取，并将提取物分成不同的极性段，采用室内生物测定的方法，对不同极性段进行化感活性筛选；对化感活性极性段利用中压制备色谱、高速逆流色谱等现代分离技术，进行系统的分离研究，制备化感化合物单体；利用现代波谱手段对分离鉴定出的怀山药化感物质进行结构解析；利用高效液相色谱和毛细管电泳等技术，建立化感物质的定性定量分析方法，从而监测种植怀山药后的土壤、植株生长过程中化感物质含量的动态变化情况；并利用室内生物测定和实际示范园区种植相结合的方法，对不同浓度化感物质单体对零余子萌发和怀山药植株生长的影响进行考察，以考察活性化合物的化感作用，探明其作用机制，为下一步进行怀山药连作障碍研究打下基础。

怀山药在河南焦作地区常年种植面积达8万多亩，但是重茬减产现象十分严重。根据当地药农介绍，怀山药5年之内不能重茬种植。虽然在实际种植过程中通过多种方法改善土壤肥力、土壤结构等，但均未能解决此问题。怀山药种植的连作障碍，已成为怀山药产业链发展中亟待解决的一个重大问题。基于以上问题，我们认为山药在生长过程中的次生代谢产物，例如山药素类等化感物质，通过茎叶挥发、淋溶、根系分泌以及植物残株的腐解等途径，在土壤中的积累释放，或许是导致山药连作障碍的一个不可忽视的重要因素。基于以上研究背景，我们申请获批了本项目。通过初期的室内生物测定法，我们确认了怀山药块茎、茎叶、零余子水提液具有化感作用，在此基础上，我们从怀山药中提取、分离、制备出山药素类化感物质单体，建立了山药皮中山药素I的提取工艺，申请国家发明专利一项。以羟基苯甲酸及其衍生物为起始物，通过酯化、酚羟基选择性甲基化、四氢铝锂还原、溴代、Wittig-horner反应及碘催化关环等步骤合成制备了十余种山药素类化合物，为化感作用研究打下基础。建立了山药素类化合物的HPLC定量分析方法，测定了怀山药植株不同部位山药素类化合物的含量，为化感活性化合物含量的定期检测提供基础。同时建立了无需标准品即能对山药皮中山药素I及其衍生物含量直接进行测定的核磁定量分析方法，为新发现的无标准品的化感物质含量测定提供了基础。并研究了山药素化合物单体的化感作用，山药素1对拟南芥种子萌发无明显抑制作用，山药素III、IV、V在较高浓度时表现出明显的抑制作用。后期对比怀山药的块茎、茎叶和山药皮的水提液化感作用，结果表明除山药素类化合物外，怀山药的块茎、茎叶和山药皮的水提液中还含有其它化感物质，对拟南芥种子的萌发有协同抑制作用。项目实施过程中，我们还对山药素类化合物的降血糖活性进行了研究，相比于阿卡波糖山药素I、III 、IV表现出更优的α-D-葡萄糖苷酶抑制活性。项目的研究结果将为进一步研究怀山药化感自毒作用及怀山药规范化种植提供理论依据和科学指导，并对以山药素类化合物为主的降糖新药的研发等具有重要的现实意义。