怀山药微型块茎诱导形成的分子机理研究

Disocorea opposita Thunb．is one of the famous "Si Da Huai Yao". Research on the mechanisms for induced formation of its microtuber is very important for controling its formation and also for application in cultivation. In this project application, changes in morphology and physiological and chemical indexes during the process of the microtuber induced formation will be investigated based on our established techniqual system. The difference of the functional genes and protein during different stages of the microtuber induced formation will be researched by using the new techniques such as transcriptnomics, proteomics and pyrosequencing, etc. Some candidate genes and their whole cDNA sequences will be determined. The roles of the candidate genes will be confirmed by transformed test tube plants mediated by Agrobacterium. Based on the above research, the molecular mechanisms of microtuber induced formation for Disocorea opposita Thunb．will be elucidated and new genes related with formation and development are hopeful to obtain from the candidates.

怀山药是我国著名的"四大怀药"之一，其微型块茎诱导形成机理的研究对于调控微型块茎形成以及栽培应用具有重要意义。本项目拟在已建立微型块茎诱导形成技术体系的基础上，研究微型块茎诱导形成过程中的形态、生理生化指标变化和规律；利用转录组学、蛋白质组学、高通量测序等最新的分子生物学技术研究怀山药微型块茎诱导形成过程的不同时期功能基因和蛋白质表达差异，找到与微型块茎诱导形成相关的候选基因；通过RACE技术获得候选基因的cDNA全长，通过农杆菌介导转化非诱导试管苗验证所得到的基因对微型块茎形成的作用，从而从分子角度阐明怀山药微型块茎诱导形成的机制；并从克隆的候选基因中有望获得与微型块茎形成发育相关的新基因。

怀山药是我国著名的“四大怀药”之一，其微型块茎诱导形成机理的研究对于调控微型块茎形成、生产以及应用具有重要意义。. 本项目主要研究内容包括微型块茎形成技术体系的建立、微型块茎形成中形态解剖与生理生化变化规律、转录组学、蛋白质组学、候选基因的克隆、遗传转化体系的建立与候选基因功能的验证等方面。通过研究，建立了怀山药微型块茎诱导形成的一步诱导和三步循环诱导技术体系，系统研究了微型块茎形成过程中形态、解剖、生理生化、内源激素的变化规律，探明了蔗糖、淀粉、IAA、ABA、ZR等与微型块茎形成的关系；研究了常用内参基因的表达量变化，筛选出了微型块茎形成不同时期适合的内参基因；通过转录组学和蛋白质组学研究，在微型块茎形成过程中共获得71,739个unigene和3081种蛋白质，对其进行了GO、KOG、KEGG pathway分类和功能注释，发现了大量的具有特定功能的基因和蛋白质，如与生长相关的基因有103个、与碳水化合物转运和代谢相关的基因有496个等，其中与微型块茎形成相关的差异表达基因有9576个、差异表达蛋白有1036个；从其中的39个表达显著的差异基因中筛选出了2个具有自主知识产权的可能与微型块茎形成相关的锌指蛋白基因（DOBBX6、DOBBX17）为候选基因，对其进行了克隆、测序、结构分析和定位等系列研究，构建了过表达载体和沉默载体，通过农杆菌介导建立了微型块茎薄片遗传转化体系，经过GUS组织化学和PCR检测获得了转基因植株，通过转基因植株与非转基因植株形成微型块茎的比较进一步验证候选基因的功能。. 本研究建立的一步诱导法为微型块茎诱导形成机理的研究提供了理想模型，三步循环诱导法为微型块茎的生产应用奠定了技术基础；探明的微型块茎形成的生理生化规律，为微型块茎形成的调控奠定了理论基础；转录组学和蛋白质组学获得的大量差异表达基因和差异蛋白信息为深入研究微型块茎的形成提供了重要的分子数据；遗传转化体系的建立，为候选基因的功能验证和通过基因工程培育怀山药新品种奠定了技术基础。