基于线粒体自噬探讨青光安对青光眼模型RGCs保护作用的机制研究

Apoptosis of retinal ganglion cells (RGCs) is a direct cause of blindness in glaucoma. Previous research found that: Qingguangan granules are effective drugs for the protection of optic nerve in glaucoma and can inhibit the apoptosis of RGCs. In glaucoma, mitochondrial autophagy is enhanced, which is beneficial to the protection of RGCs, but if the process of mitochondrial autophagy is not complete, it will lead to apoptosis of RGCs. This puts forward the scientific hypothesis that Glaucoma has a protective effect on RGCs, which is mediated through the regulation of mitochondrial autophagy of RGCs, and can guarantee the integrity of its autophagy pathway..This topic evaluates the regulation of RGCs mitochondrial autophagy from three aspects: (1) To evaluate whether Qingguangan can enhance mitochondrial autophagy in glaucoma model RGCs: using electron microscopy or fluorescent labeling. (2) To evaluate whether glaucoman can protect mitochondria of RGCs through a complete autophagy pathway: mainly rely on LC3-II/LC3-I ratio and LAMP1 expression. (3) To evaluate whether mitochondria pass the complete autophagy pathway, and whether RGCs have protective effect: Use RGCs fluorescence counting, Hoechst method and related protein expression to detect cell apoptosis. After blocking the mitochondrial autophagic ubiquitination pathway with 3-MA, the RGCs protective effect of Qingguang'an was evaluated again.

视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡是青光眼致盲的直接原因。前期研究发现：青光安颗粒剂是青光眼视神经保护的有效药物，能抑制RGCs凋亡。青光眼状态下，线粒体自噬增强，本有益于RGCs保护，但如果线粒体自噬的过程不完整，则反而导致RGCs凋亡。由此提出科学假说：青光安对RGCs具有保护作用，是通过调控RGCs的线粒体自噬介导的，能保障其自噬途径的完整性。.本研究拟从3方面论证假说成立，评价青光安对RGCs线粒体自噬的调控：①评价青光安能否增强RGCs的线粒体自噬：采用电镜、荧光标记观察。②评价青光安能否保障RGCs的线粒体通过完整的自噬途径：主要依靠LC3-Ⅱ/LC3-I比值和通路相关蛋白表达。③评价线粒体自噬通过完整途径后，是否产生了RGCs保护的效应：采用RGCs荧光计数、Hoechst法和相关蛋白表达检测细胞凋亡。并使用3-MA阻断线粒体自噬泛素化途径后，再次评价青光安的RGCs保护效应。

线粒体自噬对于神经细胞非常重要，线粒体自噬对于视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）是一把“双刃剑”，线粒体自噬本可以起到保护RGCs的作用，但如果线粒体自噬紊乱将导致RGCs的凋亡。.青光安颗粒剂成熟应用于青光眼患者的视神经保护已逾30年，既往对其机制研究发现：青光安颗粒剂可有效抑制青光眼动物模型的RGCs凋亡，抑制视网膜组织中氧化损伤等；但青光安颗粒剂能否调节RGCs中的线粒体自噬，目前还没有相关研究。.本课题组从青光安颗粒剂调节RGCs线粒体自噬的角度着手，对其调节机制及途径进行研究，考察青光安颗粒剂介导RGCs保护的关键在于是否能形成“有益的线粒体自噬”，取得了以下研究结果：.1.动物水平研究表明：青光安颗粒剂能显著降低青光眼动物模型的眼压；能增加慢性高眼压模型大鼠视神经节细胞中Parkin、Bcl-2的表达，抑制optineurin、LAMP1、LC3-II/LC3-I的表达，降低DBA/2J小鼠视网膜中LC3-II/LC3-I、Caspase-3的蛋白表达，调控DBA/2J小鼠视神经中Parkin、LAMP1、LC3、Caspase-3、CytC的表达，从而证明青光安颗粒剂对RGCs线粒体自噬具有抑制作用，可在一定程度上降低视网膜中过剩的线粒体自噬数量，降低RGCs的凋亡。.2.细胞水平研究表明：以谷氨酸诱导大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡，青光安颗粒剂含药血清干预后，能够通过减少LDH的释放，减少RGC-5受损程度，并抑制CytC的释放从而抑制Caspase-3的激活，逆转了由谷氨酸诱导RGC-5细胞所致的细胞凋亡。同时青光安颗粒剂含药血清能够降低RGCs中LAMP1蛋白的表达及LC3-Ⅱ/LC3-I的比值，表明青光安能够调控线粒体自噬相关通路抑制凋亡，对RGCs起到保护作用。