鸡传染性支气管炎病毒S蛋白介导的细胞侵染机制研究

Avian infectious bronchitis virus (IBV) belongs to family of Coronaviruses.Interaction between S protein of IBV and its cellular receptor initiates subsequent infection. Aminopeptidease N （APN） was identifed as functional receptor for several coronaviruses. Nevertheless, The putative receptor of IBV and infection mechanism of this virus are still unknown so far. In this study, the total RNA will be extract from chicken tissues and chicken APN (ChAPN) will be amplified by RT-PCR. The ChAPN was expressed and used to generated both monoclonal and polyclonal antibodies. Unsusceptible cells will be tranfected with ChAPN-expressing plamsmid followed by infection of IBV. Tissue distribution of ChAPN will be analyzed by immunohistochemistry using anti-ChAPN antibody. Blocking effect of anti-ChAPN antibody on IBV infection will be analyzed using plaque and immunofluorescence assays. Cell entry of IBV will be analyzed by VSV-derived pseudotypes bearing IBV S protein. Localization of ChAPN on polarized cells will be analyzed by laser confocal immunofluorescences (LCI) and Western blot. Colocalizaton of IBV S/ChAPN and lipid rafts marker is to be analyzed by LCI and Western blot. Association of cholesterol with IBV entry, replicaiton and release will be investigated by virus plaque, real-time PCR and immunofluorescence assays. Above-mentioned results are basis for elucidation of infectious entry of IBV.

传染性支气管炎病毒是冠状病毒属成员。IBV通过其囊膜蛋白S与细胞膜受体相互作用进入细胞引起感染。氨肽酶N（APN）已被鉴定是多种冠状病毒的细胞受体，但目前IBV的受体没有得到鉴定，同时其感染机制也不清楚。本研究拟用RT-PCR扩增鸡APN(ChAPN)，表达后制备其抗体。在IBV非易感细胞表达ChAPN后分析IBV对这些细胞的感染。用ChAPN抗体检测ChAPN组织分布及其对IBV感染的阻断。将IBV S蛋白展示在水泡性口炎病毒（VSV）表面制备假病毒V-IBV-S，并感染极性化的IBV靶细胞确定IBV侵染途径；分析IBV感染与ChAPN细胞定位的相关性。用共聚焦免疫荧光和Western blot共定位IBV S蛋白、ChAPN和细胞脂筏Marker，并确定膜胆固醇对IBV感染力、病毒复制和释放的影响，分析IBV感染与细胞脂筏的关系。通过上述实验阐明IBV S蛋白介导的细胞侵染机制。

IBV是冠状病毒属成员，其通过其囊膜蛋白S与细胞膜受体相互作用进入细胞引起感染。氨肽酶N（APN）已被鉴定是多种冠状病毒的细胞受体，但目前IBV的受体没有得到鉴定，同时其感染机制也不清楚。构建真核表达质粒pcDNA-gAPN并转染Hela细胞，IBV Beaudette株进行感染表明其可以感染转染gAPN的Hela细胞，并产生感染性病毒粒子。IFA和激光共聚焦证明gAPN可以介导IBV感染细胞，gAPN的荧光位于细胞膜，病毒的荧光位于细胞浆内。不同IBV毒株感染实验进一步证实其可靠性。少量gAPN即可介导病毒的感染，感染量与gAPN的表达量呈正相关。IFA证实gAPN的受体结合部位位于gAPN的945～1 695 bp之间。pcDNA3.1-cAPN转染MDCK细胞，G418筛选和多次克隆筛选出稳定表达cAPN基因的细胞株，RT-PCR和IFA表明cAPN在获得的MDCK细胞中可以稳定表达，并命名为MDCK-cAPN。病毒感染实验表明IBV可以感染MDCK-cAPN细胞，并且在接种后24 h后出现了典型的细胞病变。以IBV SC021202株作为参考毒株设计了20对引物，利用RT-PCR法对IBV HH06株的内部基因组序列进行分段扩增，同时利用RACE Kit试剂盒对基因组的非编码区5’UTR和3’UTR进行扩增。结果显示 IBV HH06株全基因组由27 663个核苷酸组成，具有典型IBV基因序列特征。对不同毒株的全基因组及各个基因的序列大小进行比较，发现各毒株间3a、3b、5a、5b和N基因长度最保守，序列大小一致；5’UTR、3b、E和M基因进化相对较保守，序列大小差异较小；基因的缺失和插入主要发生在1a、1b、S基因和3’UTR区域。系统进化树分析显示HH06株始终与SC021202株具有较近的亲缘关系，而与Mass型毒株亲缘关系较远。利用Real Time PCR和病毒滴度试验，分析细胞膜胆固醇是否在IBV感染鸡胚肾（CEK）细胞时起作用，结果显示用胆固醇萃取剂甲基-β-环糊精去除细胞膜胆固醇后，可剂量依赖性的抑制IBV感染CEK细胞，同时补充外源性胆固醇后，IBV感染力可得到部分恢复。去除细胞膜胆固醇影响IBV的侵入和释放过程。而去除病毒包膜胆固醇则对IBV感染力无显著影响。综上结果表明，IBV S蛋白通过与gAPN互相作用并介导该病毒的细胞侵染过程。