噬菌体随机肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白亲和肽研究

鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，严重危害世界养禽业健康发展。IBV表面纤突S蛋白氨基端的S1蛋白与宿主细胞受体相互作用介导病毒囊膜与细胞膜融合及随后的感染。本研究采用原核表达系统在大肠杆菌中高效表达IBV S1蛋白；以纯化的S1蛋白为靶蛋白，利用噬菌体12肽随机多肽库与其结合后进行生物淘洗，筛选出含S1蛋白特异性结合多肽的噬菌体；通过序列测定确定亲和肽序列并与参照序列进行比较，推导出IBV潜在的受体或受体结合区；化学合成亲和肽后进行IBV与受体结合的阻断试验；利用病毒蚀斑实验、real-time PCR 和SPF雏鸡动物实验分析多肽在体内外抗IBV感染功效与机制。利用荧光素及生物素标记的肽介导的免疫组化技术结合激光共聚焦荧光观察和免疫酶反应精确定位IBV在感染动物靶器官中的动态分布。通过本研究进一步阐明IBV的致病机理。

鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV纤突糖蛋白（Spike, S）是位于病毒粒子表面的结构蛋白，它既有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位，具有良好的免疫原性，又含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域，是病毒入侵和繁殖的关键蛋白。.本试验构建了编码IBV S1基因的原核表达质粒进行了蛋白表达，IBV多抗Western blot证实所表达蛋白具有较好生物学活性。利用噬菌体随机十二肽库，以IBV S1重组蛋白为靶分子，进行了四轮生物淘选。最终筛选出三个可以与IBV S1蛋白特异性结合的噬菌体，推导其氨基酸序列为LWAQAKSLHTLA（L）、MYSPRPPALSTV（M）和HWDPFSLSAYFP（H）。ELISA检测H多肽可以和S1蛋白特异性的结合。病毒体外抑制实验表明多肽H具有良好的抗病毒活性，可有效抑制IBV感染Vero细胞。利用筛选得到的噬菌体，建立了IBV的噬菌体介导ELISA检测方法，该方法可以有效检测IBV抗原，检测最低病毒量为1.21×105 copeis/μL，并具有较高的特异性，与ELISA、RT-PCR和Real-Time PCR比较，敏感性依次为Real-Time PCR、RT-PCR法和噬菌体ELISA法。利用FITC标记的H多肽进行免疫荧光试验，在Vero细胞和CEK细胞上证明FITC标记多肽可以有效的与IBV结合，并对鸡在感染IBV M41株后体内病毒分布进行了研究，在气管、肺脏和肾脏均能有效的检测到病毒的分布，在感染后第1 d即可在气管内检测到病毒，第3 d可以在肺脏和肾脏中检测到IBV病毒，气管持续到17d，肺脏持续到7d，肾脏持续到10d，检测效果明显优于使用多克隆抗体，具有成本低，特异性好，操作方便的优势。2周龄SPF雏鸡随机分组，先将纯化的IBV滴鼻/点眼接种，24 h后各组分别肌肉接种L、M和H亲和噬菌体1.0×1013 pfu，采集不同时期雏鸡血液和脾脏分离淋巴细胞，流式细胞仪检测机体不同时期各种T细胞亚类别的动态变化，并以IBV全病毒和S1重组蛋白分别作为抗原包被ELISA 反应板，检测雏鸡血清中抗体效价，结果表明L、M和H亲和噬菌体在雏鸡体内有很好的中和病毒的作用，其中以H亲和噬菌体的中和病毒活性最好。